人參皂苷Rg1緩解D-半乳糖致衰老大鼠脾損傷

張 晶，邵 月，張力恒，冉瑞圖，孫嘉政，張巖巖，賈道勇，張夢思，王亞平

(重慶醫科大學 干細胞與組織工程研究室 組織胚胎學教研室， 重慶 400016)

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研究論文

人參皂苷Rg1緩解D-半乳糖致衰老大鼠脾損傷

張 晶，邵 月，張力恒，冉瑞圖，孫嘉政，張巖巖，賈道勇，張夢思，王亞平*

(重慶醫科大學 干細胞與組織工程研究室 組織胚胎學教研室， 重慶 400016)

目的探討人參皂苷Rg1對D-半乳糖致衰老大鼠脾組織結構與功能的影響及其機制。方法SD大鼠隨機分為正常對照組、衰老模型組(D-半乳糖120 mg/kg,qd×42 d)、Rg1干預組(建模，第15 天起Rg1 20 mg/kg,qd×28 d)、Rg1對照組(0.9%氯化鈉注射液+Rg1)。取脾臟測定脾指數，石蠟切片觀察脾臟顯微形態，β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色檢測脾細胞衰老，CCK-8檢測脾細胞對刀豆蛋白A刺激的增殖能力，ELISA檢測IL- 2、IL- 6和晚期糖基化終產物(AGEs)含量，流式細胞術檢測細胞活性氧(ROS)，酶法檢測丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)含量，Western blot檢測細胞衰老相關蛋白P53、P21及Rb的表達。結果與衰老模型組比較，Rg1干預組大鼠脾指數、脾臟白髓面積比及脾細胞增殖能力提高(P<0.05)；脾細胞分泌IL- 2、IL- 6水平和SOD活性明顯增強(P<0.01)；脾細胞的SA-β-Gal陽性率、ROS和MDA含量下降(P<0.01)；AGEs 下降(P<0.05)；P53、P21及RB蛋白表達顯著下調(P<0.01)。結論人參皂苷Rg1能緩解D-半乳糖致衰大鼠脾損傷，其機制可能與抑制氧化損傷和下調P53-P21-RB信號通路有關。

人參皂苷Rg1；衰老模型；脾臟；大鼠

人參皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)是人參重要的藥效成分，可調控衰老及延緩造血干細胞衰老[1]。免疫系統的主要細胞起源于造血干細胞，推測人參皂苷Rg1可以延緩免疫系統衰老，調控免疫細胞的功能。脾臟是機體最大的免疫器官，在免疫功能調控中具有重要作用。本研究探討人參皂苷Rg1對D-半乳糖致衰大鼠脾結構與功能的影響及其機制，為尋找延緩免疫系統衰老的天然藥物提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

3月齡清潔級雄性SD大鼠40只，體質量180～200 g，[重慶醫科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK(渝)2007- 0001]。人參皂苷Rg1(吉林宏久生物技術有限公司，純度≥98.6%)；D-半乳糖和ConA(Sigma公司)；IL- 2和IL- 6檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；RPMI- 1640培養基(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclon公司)；CCK- 8試劑盒(上海七海復泰生物公司)；SA-β-Gal染色試劑盒、ROS與MDA試劑盒(碧云天生物技術研究所)； AGEs 試劑盒(上海源葉生物技術有限公司)；P53、P21和RB兔抗鼠多克隆抗體(Prointech公司)；羊抗兔二抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠衰老模型復制與給藥[2- 3]:將大鼠隨機分為4組，每組10只。正常對照組：注射0.9%氯化鈉溶液qd×42 d；衰老模型組：皮下注射D-半乳糖120 mg/kg,qd×42 d；Rg1干預組：注射D-半乳糖劑量與時間同衰老模型組，第15天起腹腔注射Rg1 20 mg/kg,qd×28 d；Rg1對照組：注射等量0.9%氯化鈉溶液qd×14 d，第15天起腹腔注射Rg1(同Rg1干預組)。

1.2.2 脾指數測定與形態學觀察:藥物注射后第2 天稱大鼠體質量(kg)，取脾臟稱濕重(mg)，測定脾指數[脾指數=脾臟濕重(mg)/體質量(kg)]。常規石蠟切片，HE染色，連續切片顯微鏡下觀察，以Image J 軟件計算脾白髓占脾組織切片的比例。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色檢測脾細胞衰老:制備脾臟冷凍組織切片，按試劑說明書進行SA-β-Gal酶染色[3]，光鏡下觀察分析，計算各組大鼠衰老脾細胞百分比。

1.2.4 CCK- 8檢測脾細胞增殖能力:制備脾單細胞懸液[4]，每孔5×103細胞 /200 μL 接種于96孔板中，每孔加終濃度5 mg/L的ConA，分別培養0、1、2、3和4 d，各孔加10 μL CCK- 8，450 nm波長酶標儀測定吸光度值(A值)。

1.2.5 ELISA檢測脾細胞分泌IL- 2及IL- 6水平:按1.2.4方法制備和培養脾細胞，培養48 h，收集培養上清液，按照試劑盒說明書檢測各組上清液中IL- 2及IL- 6含量。

1.2.6 ELISA檢測血清中晚期糖基化終產物(AGEs)含量:采取外周血，4 ℃過夜后收集血清，2 500 r/min×20 min，離心2次，吸上清液，按ELISA檢測試劑盒說明書檢測血清中AGEs含量。

1.2.7 流式細胞術及酶法檢測細胞氧化及抗氧化能力:收集1.2.4制備的各組脾細胞，加入1 mL DCFH-DA，37 ℃ 孵育 25 min，培養液洗滌細胞3次，流式細胞術檢測脾細胞內ROS水平，以 DCF的平均熒光強度表示其含量。收集培養上清液，酶法檢測SOD與 MDA的含量。

1.2.8 Western blot檢測衰老相關蛋白:提取各組脾細胞總蛋白，調整蛋白濃度40 μg/泳道，12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，P53、P21和RB一抗(均1∶200)、β-actin抗體(1∶4 000)4 ℃孵育過夜，洗膜，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，洗膜，ECL發光系統顯色。用FluorSTM Multimager 圖像分析儀，Quality-One4.11軟件進行圖像灰度掃描。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 人參皂苷Rg1對衰老大鼠脾指數與組織形態學的影響

衰老模型組脾臟指數明顯下降(P<0.01)，Rg1干預組能顯著增加脾指數(P<0.05)(表1)。衰老模型組白髓與紅髓界限模糊，白髓面積比顯著下降(P<0.01)， Rg1干預組大鼠脾白髓面積比增加(P<0.05)(表1，圖1)。

表1 各組大鼠的脾指數及白髓面積比

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.05 compared with aging model group.

圖1 各組大鼠脾臟的組織形態 Fig 1 Spleen structure in each group (×100)

2.2 人參皂苷Rg1對衰老大鼠SA-β-Gal染色陽性脾細胞影響

脾細胞胞質呈藍色為SA-β-Gal陽性細胞，著色深淺與著色面積同脾細胞衰老程度呈正相關。衰老模型組陽性細胞數顯著增多(P<0.01)，Rg1干預組陽性細胞數明顯減少(P<0.01)(圖2，3)。

圖2 各組大鼠脾臟SA-β-Gal染色結果Fig 2 SA-β-Gal staining positive splenocytes in each group(×200)

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group圖3 各組大鼠SA-β-Gal染色陽性脾細胞數量比較Fig 3 SA-β-Gal staining positive splenocytes

2.3 人參皂苷Rg1對衰老大鼠血清中晚期糖基化終產物(AGEs)含量的影響

衰老模型組的AGEs含量顯著增加(P<0.05)；Rg1干預組能顯著降低血清AGEs含量(P<0.01)(表2)。

表2 各組大鼠血清中AGEs含量比較

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.05 compared with aging model group.

2.4 人參皂苷Rg1對衰老大鼠脾細胞增殖能力的影響

衰老模型組大鼠脾細胞對ConA刺激的增殖能力明顯降低(P<0.05)；Rg1干預組大鼠脾細胞對ConA刺激的增殖能力增強(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with normal control group；#P<0.05 compared with aging model group圖4 各組大鼠脾細胞增殖能力比較Fig 4 Proliferative rate of splenocytes in each

2.5 人參皂苷Rg1對衰老大鼠脾細胞分泌IL- 2和IL- 6水平的影響

衰老模型組大鼠脾細胞分泌IL- 2和IL- 6水平明顯降低(P<0.01)；Rg1干預組大鼠脾細胞分泌IL- 2和IL- 6水平回升(P<0.01)(表3)。

2.6 人參皂苷Rg1對衰老大鼠脾細胞產生活ROS、SOD及MDA水平的影響

衰老模型組大鼠脾細胞產生ROS、MDA水平顯著升高(P<0.01)，SOD 活性顯著下降(P<0.01)；Rg1干預組大鼠脾細胞產生ROS、MDA水平明顯降低(P<0.01)，SOD 活性顯著升高(P<0.01)(表4)。

表3 各組大鼠脾細胞分泌IL- 2和 IL- 6水平比較

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group.

表4 各組大鼠脾細胞產生活ROS、SOD與MDA水平比較

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group.

2.7 人參皂苷Rg1對衰老大鼠脾細胞表達P21、P53及RB蛋白的影響

正常對照組P21、P53及RB蛋白低表達，衰老模型組P21、P53及Rb蛋白表達上調(P<0.01)，Rg1干預組脾細胞中P21、P53及RB蛋白表達量有所降低(P<0.01)(表5，圖5)。

表5 各組大鼠脾細胞P53、P21及RB蛋白表達

*P<0.01 compared with normal control group；#P<0.01 compared with aging model group.

1.normal control group；2.Rg1 control group；3.aging model group；4.Rg1 intervention group圖5 各組大鼠脾細胞P53、P21及RB蛋白條帶Fig 5 P21、P53 and RB protein bands in each group

3 討論

本實驗探究Rg1對D-半乳糖致衰大鼠脾結構與功能影響，從抗氧化損傷和調控P53-P21-RB信號通路兩方面研究Rg1緩解脾損傷及脾衰老的機制。

本研究采用D-半乳糖致大鼠衰老模型，發現大鼠脾指數、脾臟白髓面積比、脾細胞對ConA作用的增殖能力及分泌IL- 2、IL- 6水平均明顯下降，SA-β-Gal染色陽性率增加，提示D-半乳糖建立的衰老模型可導致大鼠脾臟結構與功能損傷，可用于免疫器官衰退相關生物學研究[5- 6]。

脾指數是代表脾臟大體形態的重要指標，而脾臟白髓是脾臟組織學的實質結構。Rg1明顯減輕脾臟萎縮程度，提高脾指數和脾臟白髓面積比例，提示Rg1能拮抗D-半乳糖對脾臟結構的破壞。研究脾細胞的功能狀態能有效反映脾臟功能。Rg1可提高脾細胞對ConA刺激的增殖能力和分泌IL- 2及IL- 6水平，減少SA-β-Gal染色陽性率及AGEs積聚，提示Rg1能緩解D-半乳糖誘導的脾細胞衰老，促進脾細胞增殖，激活脾細胞功能。

細胞內ROS水平增加和抗氧化能力下降是導致細胞衰老的關鍵因素[7]。ROS可作用于脂質發生過氧化反應，產生MDA，其具有細胞毒性；還可作為細胞信號傳導和基因表達調控分子，對細胞增殖分化、細胞凋亡和細胞衰老具有調控作用[8- 9]。機體中SOD能有效清除生物氧化產生的超氧陽離子自由基[10]。本實驗證明， Rg1可明顯減少脾細胞產生ROS和MDA水平，顯著提升SOD的活性，表明Rg1可能通過抑制D-半乳糖所致的氧化損傷，延緩大鼠的脾衰老。

P53-P21-Rb是重要的細胞衰老信號傳導通路，抑癌基因P53的激活可上調P21的表達，從而抑制CDK2/Cyclin E復合物的活性，阻止細胞從G1期向S期轉變[11- 12]。P21是一種細胞周期抑制蛋白，可通過抑制細胞CDK2 和CDK4 的活性，進而抑制Rb和轉錄因子(E2F)的磷酸化過程，誘導細胞生長停滯[13]。本實驗發現，人參皂苷Rg1能顯著降低衰老大鼠脾細胞P53、P21及RB蛋白的表達，推測Rg1可以下調P53-P21-RB衰老信號通路，這可能是Rg1緩解大鼠脾衰老或損傷機制之一。

[1] Yue Z, Rong J, Ping W,etal. Gene expression of the p16 (INK4a)-Rb and p19 (Arf)-p53-p21 (Cip/Waf1) signaling pathways in the regulation of hematopoietic stem cell aging by ginsenoside Rg1[J]. Genet Mol Res, 2013, 13: 10086- 10096.

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新聞點擊

對抗腦癌新療法——釣出癌細胞

據英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2014年2月19日報道，美國研究人員公布治療腦癌的新療法，使用納米纖維從腦部誘出癌細胞。

這套療法利用與腫瘤擴散相同的方法，將癌細胞“誘離”。研究人員利用聚合物制作出一種纖維，纖維表面模仿癌細胞通常通過的神經與血管結構，植入長有人類神經膠母細胞瘤的小鼠腦部。這種纖維的直徑只有人類頭發的一半，用來引導腫瘤，將移動中的癌細飽引至含有環巴胺(cyclopamine)的“腫瘤采集膠”。環巴胺可用來毒殺癌細胞。

專家認為，這項技術能有效反對最具侵襲性癌癥之一的神經膠母細胞瘤(glioblastom)。神經膠母細胞瘤如此難以治愈的因素之一是惡性細胞，可通過神經纖維與血管擴散到其他部位。

如今研究人員已經學會如何阻滯這種移動機制，使用比人發纖細的納米纖維膜，把腫瘤細胞誘離。

主要研究人員、美國喬治亞理工學院暨艾莫瑞大學(Georgia Tech and Emory University)柯爾特生物醫學工程系(Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering)系主任貝勒康達(Ravi Bellamkonda)說：“我們設計了聚合物納米纖維膜，模仿腦瘤細胞用來入侵其他部位的神經與血管結構?！?/p>

這項技術發表于2014年《自然材料》(Nature Materials)期刊上。

高齡產婦胎兒出現先天性異常概率未必增高

據美國國家科學院院報(PNAS)網站(2014-02-19)報道，最近在母體與胎兒醫學會年會上，一項美國研究報導了一個令人驚訝的新發現，與年輕產婦相比，高齡產婦所懷的胎兒出現某些先天性異常的狀況反而比較少。這顯然與過去的認知相反，研究也表示這是初步性的發現，未來還需進一步研究。

研究分析，華盛頓大學醫學院進行第二孕期超聲波檢查的76 000個胎兒數據分析，這些數據橫跨18年。研究以孕婦35歲作為分界線，經過調整煙酒使用、妊娠糖尿病、非裔美國人族群等變項后，發現只有1.7%高齡產婦的胎兒有重大先天性缺陷，但35歲以下的年輕孕婦有相同情形的比例卻為2.6%。其中高齡產婦之胎兒出現較少的重大缺陷項目，包括中樞神經系統、腎臟及腹壁缺陷。心臟缺陷兩組無顯著差異。

研究推測這可以用“適者生存”的道理來解釋，年長女性若懷有重大缺陷的胎兒，最后可能都會以妊娠失敗或流產結束，而可以存活下來的通常會是正常的胎兒。此外，年長的媽媽可能也比較注重健康的生活型態(補充產前維生素、均衡飲食及運動)，有益胎兒健康發展。不過由于研究缺乏包括父親年齡、罕見不良事件等信息，所以難以找出造成這個研究結果背后真正的原因。

研究主要作者Goetzinger醫學博士認為，這個結果并非要降低對高齡產婦進行基因性異常的檢測或其他懷孕風險的重視，高齡婦女懷孕生下健康寶寶的概率可能比我們以前所想的要高一些。

該研究刊登于新一期母體與胎兒醫學會年會(Annual meeting of the Society of Maternal-Fetal Medicine)。

Ginsenoside Rg1 relieves the injure of the spleen in aging rats induced by D-galactose

ZHANG Jing, SHAO Yue, ZHANG Li-heng, RAN Rui-tu, SUN Jia-zheng, ZHANG Yan-yan,JIA Dao-yong, ZHANG Meng-si, WANG Ya-ping*

(Dept. of Histology and Embryology, Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering, Chongqing Medical University, Chongqing 400016,China)

Objective To investigate the effect of ginsenoside Rg1 on the spleen structure and function of aging rats and its relative mechanism.Methods Forty SD rats were randomly divided into normal control group, aging model group (D-galactose 120 mg/kg,qd×42 d), Rg1 intervention group(D-galactose 120 mg/kg,qd×42 d and Rg1 20 mg/kg, from day 15th,qd×28 d) and Rg1 control group. After finishing injections the spleen index was measured, paraffin sections were then made to observe spleen microscopic structure. Senescence-associated β-Galactosidase(SA-β-Gal) stain was used to detect aging splenocytes. The proliferative capacity of splenocytes stimulated with Concanavalin A (ConA) was measured by CCK- 8. The content of IL- 2,IL- 6 and advanced glycosylation end products(AGEs) was detected by ELISA. The level of ROS was analyzed by flow cytometry(FCM). Malondialdehyde(MDA), superoxide dismutase (SOD) were detected by enzymatic assay. The expression of senescence-associ-ated protein P53,P21 and RB were detected by Western blot analysis. Results Comparing the Rg1 intervention group with the aging model group, spleen index, splenic white pulp area proportion, the proliferative capacity of splenocytes were significantly increased (P<0.05);The secretory capability of IL- 2 and IL- 6, the active content of SOD were obviously increased(P<0.01);The percentage of SA-β-Gal positive splenocytes, the productions of ROS and MDA were significantly decreased (P<0.01);The production of AGEs was decreased (P<0.05);The expressions of P53,P21 and Rb were also significantly down-regulated (P<0.01).Conclusions Ginsenoside Rg1 relieves injure of the spleen in aging rats induced by D-galactose.It is suggested that the mechanism may be Rg1 inhibiting oxidative stress and down-regulating P53-P21-RB signaling pathway.

ginsenoside Rg1; aging model; spleen; rat

2015- 03- 19

2015- 05- 27

國家自然科學基金(30973818)；國家教育部博士導師基金(20125503110006)；重慶醫科大學學生創新基金(201314)

1001-6325(2015)10-1308-06

R392.5

A

*通信作者(corresponding author)：ypwangcq@aliyun.com