血栓和止血檢測的臨床應用

王學鋒

(上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院檢驗科，上海200025)

血栓和止血涉及機體的凝血、抗凝、纖維蛋白溶解系統等諸方面的功能，其缺陷可以引起出血性或血栓性疾病。雖然相關的檢測目前已經開展得相當廣泛，如何使這些檢測指標在臨床監測中發揮作用，為臨床疾病的診斷和治療提供準確的信息，是檢驗醫學工作者面臨的任務。

一、血栓和止血檢測在出血病診斷中的應用

出血病由一期止血缺陷和二期止血缺陷導致，前者主要指血管壁和血小板缺陷導致的出血，而后者主要是由凝血、抗凝缺陷所導致。

1.一期止血缺陷 參與一期止血的有血管內皮細胞、血小板及纖維蛋白原等，其數量和質量異常均可以導致出血。常用的篩選試驗是出血時間和血小板計數。出血時間的延長可伴有血小板計數升高、正常或降低，均是出血病的實驗室檢查表現。血小板計數增高，部分患者患骨髓增殖性腫瘤(myeloproliterative neoplasms，MPN)，一些伴有JAK2 V617F突變，表現為出血時間延長，可有出血、血栓或無明顯臨床癥狀。血小板計數減少最多見于免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia purpura，ITP)患者，是由各種原因引起的體內產生針對自身血小板的抗體所致。ITP的診斷目前多是排除性診斷。使用流式微球技術檢測血小板上的自身抗體具有敏感性高、特異性強的特點。需要注意的是，相當多的患者出血時間延長合并血小板計數正常，此時不能忽視先天性或獲得性血小板功能障礙性疾病的存在。前者較多見的是血小板無力癥，后者常見于各種抗血小板治療過程中。篩選試驗陽性結果，往往需要進一步的實驗室檢測進行確診。(1)血管性血友病(von willebrand disease，vWD)相關檢測主要有血管性血友病因子抗原(von willebrand factor antigen，vWF:Ag)、瑞斯托霉素輔因子、凝血因子Ⅷ活性(factorⅧ coagulant activity，FⅧ:C)檢測及瑞斯托霉素誘導的血小板聚集試驗、凝血因子Ⅷ結合試驗、膠原結合試驗和血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)多聚體分析等。根據上述試驗的結果，可以將vWD分成1型、2型和3型。(2)血小板無力癥相關檢測，各種誘導劑誘導均無法引起血小板聚集反應;血小板膜表面CD41和CD61流式細胞檢測明顯降低甚至缺如。基層單位若無法實施上述檢測，顯微鏡下可以觀察到血涂片上血小板散在分布，無成簇聚集現象。服用抗血小板藥物的患者，不同程度出現血小板聚集功能受抑制的情況。(3)低/無纖維蛋白原血癥或異常纖維蛋白原血癥患者可有出血時間延長或血小板聚集功能異常。患者的凝血酶時間(thrombin time，TT)，活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、止血時間(reptilase time，RT)均有不同程度的延長，用clauss法結合免疫比濁法測定纖維蛋白原含量。

需要指出的是，作為一期止血的篩選試驗，出血時間并未被淘汰，而是方法學上推薦使用模板法檢測。國際上普遍使用PFA-100檢測血小板功能、抗血小板藥物的療效和vWD，具有操作簡便、敏感性好和特異性強等特點。近來該款儀器已經升級換代為PFA-200并在國內通過注冊。

2.二期止血缺陷 常用的篩選試驗是凝血酶原時間(prothrombin time，PT)和 APTT測定。該2項檢測是各級醫院開展頻率最高的凝血常規檢測項目。根據兩者同時檢測的結果，可以大致對凝血因子缺陷癥進行分類。進一步行單個凝血因子的檢測，可以對各類凝血因子缺陷性疾病作出診斷和鑒別診斷。臨床上最多見的先天性凝血因子缺陷性疾病是血友病A(hemophilia A，HA)，絕大多數患者為男性，嚴重者出生后即可起病，表現為關節、肌肉和內臟反復出血。實驗室檢測發現APTT延長，PT正常，FⅧ:C降低，其他所有凝血因子活性正常。需要注意的是，由于各種原因引起的獲得性血友病A(acquired hemophilia A，aHA)往往也表現為APTT延長和PT正常。一般可以用APTT糾正試驗進行鑒別，若是一般的HA，患者延長的APTT可以被等量的正常人混合血漿所糾正，但若是由FⅧ:C抗體導致的APTT延長，APTT無法被等量的正常人混合血漿所糾正，這種異常隨著血漿在37℃的孵育更加容易表現出來。

3.纖維蛋白溶解系統異常導致的出血 纖維蛋白溶解系統組成復雜，作為該系統敏感的篩選試驗，聯合使用纖維蛋白(原)降解產物和D-二聚體可以完成。若僅纖維蛋白(原)降解產物升高，D-二聚體正常，往往提示患者為原發性纖維蛋白溶解功能亢進，此類患者用抗纖維蛋白溶解藥物就能得到較好的效果。如纖維蛋白(原)降解產物和D-二聚體均顯著升高，并出現血小板計數、纖維蛋白原進行性降低的情況，需要考慮彌散性血管內凝血(disseminate intravascular disease，DIC)的存在。對纖維蛋白溶解系統各個成分的檢測，可以更加明確哪種因素導致了纖維蛋白溶解系統的啟動。D-二聚體是纖維蛋白溶解系統的一個重要終產物，其水平的升高代表繼發性纖維蛋白溶解活力增強。該試驗敏感性強，但特異性非常低。若僅檢測到D-二聚體升高就理解為血栓形成，往往會導致臨床的誤診。需要指出的是，各種品牌的D-二聚體檢測其結果的一致性往往不能令人滿意。各種試劑的正常參考范圍和排除靜脈血栓的醫學決定水平各異，并非所有試劑均可以用來排除靜脈血栓形成。具有該種能力的試劑，一定需要經過大量陰、陽性標本的能力驗證并由權威部門認可。

二、血栓和止血檢測在出血病治療中的作用

缺乏因子的補充替代治療往往是出血病尤其是凝血因子缺陷癥治療的主要手段。以往，出血病是手術的禁忌證。隨著檢測技術和生物醫藥產業的發展，禁區已經被打破。在輸注一定劑量的血液制劑后，及時檢測患者體內凝血因子的水平，若達到一定高度，就可以抵御手術出血的風險。圍手術期定時檢測凝血因子的水平并給予維持，可以保障患者圍手術期的止血安全。相反，若輸注定量凝血因子后，凝血因子的血漿水平未見明顯升高，提示患者體內可能存在凝血因子的抑制物存在。若遇該種情況，千萬不能貿然手術，而是需要查明檢測結果異常的原因，及時給予處理，才能保證手術的順利實施。接觸系統的因子如凝血因子Ⅻ、激肽釋放酶原的缺乏往往導致APTT延長，但由于該類因子對止血功能貢獻有限，即使缺乏，也不會導致出血的發生。所以，并非每個凝血因子缺乏患者在手術時均需進行所缺因子的替代治療。

三、血栓和止血檢測在血栓病診斷中的作用

血栓病臨床上分為遺傳性和獲得性。體內主要抗凝蛋白如抗凝血酶(antithrombin，AT)、蛋白C(protein C，PC)、蛋白 S(protein S，PS)的先天性缺乏，可以導致血栓性疾病。對靜脈系統血栓病的檢測可以發現部分患者具備這種先天性缺陷。但臨床上大部分血栓病是各種獲得性原因導致的，常用的血栓和止血檢測可能無法檢測出單一的致栓原因，但可以從血管壁、血小板、凝血、抗凝、纖維蛋白溶解系統的檢測中發現一個或幾個方面的異常。事實上，除FⅧ:C，vWF:Ag、纖維蛋白原外，常規可以選擇的高凝狀態檢測指標并不多;所謂止凝血過程中所形成的分子標志物臨床實際應用價值有限。目前，血栓彈力圖(thrombelastogram，TEG)可以檢出患者體內的凝血功能和/或血小板功能亢進，為臨床診療提供依據。

四、血栓和止血檢測在血栓病治療中的應用

肝素和相對分子質量肝素是最常用的腸外抗凝制劑，其作用主要依賴AT質和量的正常。因此，肝素/低相對分子質量肝素抗凝治療實施以前，必須進行AT活性的檢測。若AT活性低于70%，肝素治療效果降低;AT活性低于50%，則肝素失效。檢測中發現這種情況后，要及時補充含AT制劑，國內主要是血漿。以往，肝素治療的監測指標是APTT。但該指標目前認為有較多局限性。目前，直接檢測肝素的含量，對臨床更有指導價值。同樣，低相對分子質量肝素在一些特殊情況如肥胖、低體重兒童、腎功能缺陷、妊娠患者或治療期間發生出血或血栓形成的患者也需要實施監測。由于肝素/低相對分子質量肝素的代謝半衰期較短，臨床實施檢測的時間對結果的準確性來說非常重要。一般肝素監測的采血時間在皮下注射后2或6 h，在預防或治療血栓時，其期望的濃度水平分別是0.1 ～0.15 U/mL(2 h)及0.3 ～0.7 U/mL(6 h)。低相對分子質量肝素監測時間，每天用藥2次者在第1次用藥后3～4 h;每天用藥1次者，在用藥后4～6 h。在預防血栓時，抗Xa期望的濃度水平是0.1～0.15 U/mL;治療血栓形成時，每天用藥1次者抗Xa水平為0.6～1.0 U/mL，每天 2次用藥者抗 Xa水平為0.8～1.3 U/mL。華法林是最常用的口服抗凝藥物，其起效慢，與食物和藥物的相互作用使其在臨床上必須依賴實驗室檢測來調節患者的血藥濃度。PT INR是監測華法林的最常用指標。同樣，抗血小板治療的有效性與患者的預后也是密切相關的。部分患者服用阿司匹林或氯吡格雷后會出現相應藥物的抵抗，嚴重者可以導致血栓事件的再次發生。目前，可以使用的抗血小板藥物的監測手段有血管舒張劑刺激磷蛋白(vasodilatorstimulated phosphoprotein，VASP)磷酸化程度、TEG和血小板聚集試驗等。不同檢測有其特有的優勢和不足。

五、血栓和止血在優生優育中的應用

由于先天性出血病和血栓病目前尚無法臨床根治，且該類疾病具有遺傳給后代的特點，如何通過實驗室檢測的手段進行優生優育干預，阻止患者的出生，是廣大檢驗醫學工作者的任務。以遺傳性出血病為例，血友病A和B臨床最為常見，且其為X染色體伴性隱性遺傳。由于男性僅有一條X染色體，一旦被累及，即成為患者;女性具有2條X染色體，1條被累及，為致病基因的攜帶者，本身不發病，但可以遺傳給后代。血友病A的基因診斷可以從先證者著手，優先檢測占血友病A重型患者的熱點突變即FⅧ內含子22倒位和內含子1，若陽性，直接可以診斷;陰性情況下可以直接行FⅧ外顯子測序，多數可以找到突變;仍舊陰性的患者可以通過MLPA檢測大缺失以及FⅧ拷貝數檢測查找異常;極少數患者可以通過二代測序發現異常。若家系中相關女性被診斷為致病基因攜帶者，可以在其妊娠中期進行羊水穿刺，獲得羊水脫落細胞，尋找是否與先證者具有相同突變來進行診斷。若結果為血友病患者，可以選擇終止妊娠。FⅨ基因較小，一般通過直接測序，多可以診斷。為保證檢測結果的準確性，血友病的基因診斷一般在直接診斷的基礎上，選擇FⅧ/Ⅸ基因內外的多態性標志進行間接診斷。在直接診斷與間接診斷二者的結果相符時，才可出具基因診斷報告。目前，植入前基因診斷已經在國內起步。其整合了輔助生殖技術和基因診斷技術，采取從受精卵中獲取個別卵裂球進行檢測，將正常卵裂球植入母體子宮的策略。理論上可以徹底阻止單基因遺傳疾病的發生，母親避免反復流產的風險。在遺傳性出血病和血栓病的優生優育中，有著極其廣闊的應用前景。