論華法林相關基因突變檢測技術

孫雪1，2 況赟1，2 陽喜定1，2 郭成賢2 陽國平2★

論華法林相關基因突變檢測技術

孫雪1，2 況赟1，2 陽喜定1，2 郭成賢2 陽國平2★

華法林為一種常用的口服抗凝藥，主要用于治療血栓栓塞性疾病。但其治療窗窄、個體差異大，容易引起血栓或出血的風險。代謝酶CYP2C9和作用靶點VKORC1基因多態性對華法林個體劑量差異有顯著影響，因此CYP2C9和VKORC1基因突變的檢測對于華法林的個體化治療具有重要的參考價值。目前用于CYP2C9和VKORC1突變檢測的方法有PCR-RFLP、TaqMan、pyrosequencing、HRM、POCT、熔解曲線分析技術、MS、DHPLC等。本文將對這些檢測方法的特點進行比較分析，以發現適合臨床應用推廣的技術檢測方法。

華法林；CYP2C9；VKORC1；基因突變檢測

自2009年國際華法林藥物基因組協會（International Warfarin Pharmacogenetics Consortium，IWPC）推出華法林劑量計算公式以來，國內外對華法林的隨機對照臨床研究成為遺傳藥理學研究的一項熱點。近年來大多數臨床試驗旨在探索代謝酶Cytochrome P450 2C9（CYP2C9）*2（rs1799853）、*3（rs1057910）和作用靶點維生素K環氧化物還原酶1（vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，VKORC1）（rs9923231）對華法林劑量的影響，并對IWPC公式進行修正及驗證等。有研究表明，CYP2C9*2及*3可解釋華法林個體劑量差異的12％，而VKORC1可解釋華法林個體劑量差異的30％［1］。因此，在華法林的臨床應用中對CYP2C9及VKORC1進行基因突變檢測顯得十分重要。高效靈敏的CYP2C9、VKORC1基因突變檢測技術能為華法林個體治療提供快捷的指導。本文將對CYP2C9、VKORC1基因突變檢測方法的研究近況進行綜述，以期發現適合臨床應用推廣的檢測方法。

1　常用的檢測方法

1.1聚合酶鏈式反應連接的限制性片段長度多態性分析（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）

PCR-RFLP是用特異設計的PCR引物擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，并直接在凝膠電泳上分辨的方法。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，會產生不同長度的DNA片段條帶。該法與限制性內切酶片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）相比，區別是以擴增替代了酶切，避免了RFLP繁瑣的DNA酶切、轉移、雜交等步驟，具有方法簡便、分型時間短等優點。PCR-RFLP大大提高了目的DNA的含量和相對特異性，是目前國內外華法林研究最為常用的基因突變檢測方法［2-9］。

Gu等［10］在進行華法林影響因素的研究時，使用了PCR-RFLP對127名關節置換患者及133名健康對照者DNA樣本進行CYP2C9及VKORC1三個位點的基因分型，結果表明該法分型快速而準確。

1.2TaqMan等位基因辨別分析

TaqMan等位基因辨別分析采用不同的熒光基團分別標記兩種特異探針，探針的兩端分別標記了熒光基團和淬滅基團。在PCR延伸過程中，具有5＇→3＇外切活性的DNA聚合酶只外切并降解與模板完全互補的探針，當被外切后，熒光基團和淬滅基團分離，從而激發出熒光。如果一種熒光信號明顯強于另一種，則表明該基因型為野生型。如果2種熒光信號都增強，則表明其為突變型。

TaqMan技術的優點在于僅使用一個反應且操作簡單，可以在單管反應中檢出樣本的基因型，可以在2小時內快速對96個樣本進行基因突變的檢測。TaqMan技術最先在Sevall發表的文章中提及［11］。2010年1項對Invader、Verigene和TaqMan三種基因突變檢測方法進行50個樣本分型的對比研究表明，TaqMan基因檢測方法較為經濟，且所需樣本DNA量較其他兩種方法少，僅需5～20 ng［12］。

2009年IWPC建立最大樣本量的模型時，即使用了TaqMan對5 052個樣本進行CYP2C9及VKORC1的基因分型［13］。該研究通過隨機抽取480個樣本進行基因分型的質量控制，結果表明，Taq-Man對CYP2C9基因分型結果的一致性為97.8％，對VKORC1基因分型結果的一致性為97.7％。先后國內外在華法林的研究中，對CYP2C9及VKORC1基因突變檢測也廣泛應用了該方法［14-18］。

1.3焦磷酸測序法（pyrosequencing）

焦磷酸測序法是測序法的一種，是新近發展起來的基于酶催化化學反應的測序技術，可以快速準確地測定一段較短的目標片段。其基本原理是4種脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）之一被加入引物延伸反應體系中，當加入的dNTP恰好與DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3′末端，同時釋放出一分子的焦磷酸，這個焦磷酸分子是一系列后續化學發光反應的必備材料。如果沒有摻入dNTP就不會產生光信號，而在加入下一種dNTP之前，反應體系中剩余的dNTP會在酶的作用下發生降解。因此，觀察導致發光的dNTP類型就能確定單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）的基因型。

焦磷酸測序法具有省時、低費用、準確性高、易于實現全自動化、可對SNP位點進行突變頻率的定量分析等優點，是近年來一種備受關注的SNP基因分型方法。與一些標準基因分型方法相比，焦磷酸測序法還存在一些不足。首先，該方法在進行PCR反應時，生物素標記引物價格較高；其次，該方法的應用限于短片段PCR產物（建議不超過200 bp），無法對較長片段的產物進行精確的測序分析，這就限制了焦磷酸測序技術在基因測序中的廣泛應用；再者，該方法對測序片段中連續的相同堿基（3個以上）的判讀容易出現誤差。2008年King等［19］將其與其他三種商業測序方法INFINITI analyzer、Invader assay、Tag-It Mutation Detection assay進行比較研究，對112個樣本進行CYP2C9及VKORC1基因分型，結果表明焦磷酸測序法對CYP2C9*2、CYP2C9*3及VKORC1分型的準確率分別為99％、100％、100％，且分型時間約為4小時。

近年又發展了一種單筒聚合酶鏈式反應-焦磷酸測序法（single-tube PCR-pyrosequencing），且在華法林研究中有應用［20-21］。與簡單的焦磷酸測序法相比，該法每次可對96個樣本進行測定，具有更省時且更經濟的特點。2014年Kim等［22］使用了1種新型的基因突變檢測方法，即多元焦磷酸測序對250個樣本進行CYP2C9及VKORC1基因突變的檢測，其結果與單焦磷酸測序法結果100％一致。測序結果通過直接測序法進行驗證，表明多元焦磷酸測序方法所得結果快速而可靠。

1.4高分辨率熔解曲線分析技術（high resolution melting，HRM）

HRM是近幾年興起的SNP及突變研究工具，HRM通過實時監測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產物的結合情況，來判斷是否存在SNP。不同SNP位點、不同基因型等都會影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區分不同SNP位點與不同基因型。HRM是在熔解曲線分析技術的基礎上發展起來的，二者的差別在于，常規熔解曲線升溫時每步升高0.5～1℃，而高分辨率熔解曲線每步升溫0.02～0.1℃；兩種熔解曲線所使用的熒光染料亦不相同，高分辨率熔解曲線必需使用飽和熒光染料，而普通熔解曲線由于對分辨率要求不高，則可使用非飽和熒光染料。HRM由于使用新型的飽和染料和高分辨率的儀器，有著極高的分辨率。

作為新一代的遺傳掃描工具，HRM具有靈敏度高、速度快、操作簡單、選擇性好、價格低廉、實現了真正的閉管操作等優點，使其越來越多的受到了廣大研究者的關注［23］。

2012年相關研究者新建立了一種用于檢測CYP2C9及VKORC1的HRM方法［24］，對100個華法林治療患者的樣本進行CYP2C9*3及VKORC1的基因分型，并將該方法與傳統的PCRRFLP、直接測序法及TaqMan探針法進行了比較，證明了該方法更簡單、更經濟、更快速。該結果促進了后續華法林研究中對HRM的使用［25-26］。

1.5即時檢測（point-of-care testing，POCT）

POCT是一種新型的即時檢測技術。2009年歐盟遺傳藥物學和抗凝治療（european pharmacogenetics of anticoagulant therapy，EU-PACT）成員發表香豆素類大型隨機對照臨床試驗方案［27］，說明將使用POCT進行基因分型，并指出該方法可在1.5小時內得到分型結果。2011年EU-PACT試驗組成員Howard等［28］發表以HyBeacon為探針而建立的新型熒光PCR基因分型方法，并以適用于POCT的標準PCR儀器Genie 1進行分型。該方法從指尖無菌采血或采靜脈血于真空管中，直接使用未經提取DNA的血樣進行基因分型。該研究通過隨機選取128個新鮮或冷凍的血液進行基因分型，同批血樣分別在其他實驗室進行Taqman及PCR-RFLP分型進行方法驗證，結果表明3種方法一致性為100％。2013年EU-PACT研究者將華法林試驗結果文章發表于新英格蘭雜志［29］，通過對455個患者的樣本進行基因分型，表明該方法從收到血樣至得到分型結果僅需2小時。通過與標準的Taqman及PCR-RFLP驗證比較，結果表明該方法更高效。

POCT的優點在于無需在實驗室操作，實現了床旁檢測；無需提取DNA，操作簡單；耗時短，可快速得到結果，適用于華法林研究及其臨床應用；費用較低，每個分析約需50美元，一般研究可以負擔；準確性高。但該方法的缺點在于需要特定的HyBeacon探針及Genie 1分型儀器，一般實驗室可能尚不具備；POCT目前僅在EU-PACT大型臨床試驗中得以驗證，其準確性有待進一步通過大樣本量驗證，因此該方法有待臨床進一步驗證和推廣。

2　其他檢測技術

2.1熔解曲線分析技術（melting curve analysis）

熔解曲線分析技術的基本原理是利用熒光標記的DNA探針與目標DNA互補，進而發射熒光，而未被結合的熒光標記DNA探針將猝滅。與探針結合序列的多態性將引起堿基對的錯配，從而破壞探針，使其融解即變性。與野生型相比，突變型在不同溫度下發射的熒光也有相應的改變，熒光的負導數的變化作為溫度的函數，將生成表明樣本基因型的特征峰。

2008年的一項比較研究表明，該方法的缺陷為目的基因臨近的未知基因多態性的干擾，這也限制了該方法的廣泛應用［30］。但通過設計更好的探針，可消除該潛在缺陷。

2.2質譜法（mass spectrometry，MS）

MS檢測方法的原理是使用質譜直接或間接檢測等位基因特異性延伸來區分反應產物。各種等位基因區分反應如單堿基延伸及其變化形式、等位基因特異性肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）、Invader、堿基特異性裂解和等位基因特異性PCR均已成功地和質譜檢測法聯合應用。因為質譜法測定的是DNA分子的基本性質即反應產物的分子量，因而是最直接的檢測方法，不需任何標記物。2009年IWPC研究中，部分VKORC1的基因分型即應用了該方法。

MS檢測方法的優點是高分辨率，可以輕易區分僅相差一個堿基的DNA分子；分析時間短，分析每個樣品只需幾毫秒，所以即使MS逐個分析每個樣品，檢測通量仍然很高；通過合理的設計探針，可實現中度的多重化。MS檢測方法的最大缺點是對分析樣品純度要求苛刻，隨著對產品純化過程的改進，可以克服這個不足。

2010年Yang等［31］報告了一種新型的表面增強激光解吸電離飛行時間質譜（surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-filght mass spectrometry，SELDI-TOF MS）分型方法。通過DNA雙向測序法對189個樣本的SELDI-TOF MS檢測結果進行準確性評估，結果一致性為100％。該方法與傳統的MS法比較，簡化了操作過程，取消了許多繁瑣的試驗步驟，檢測CYP2C9及VKORC1三個位點突變所需時間少于5小時，該分型方法的準確性已通過雙向DNA測序得以證實。這種新型的多重復路基因分型方法提供了良好的臨床試驗平臺，促進了華法林個體化用藥的臨床研究。

2.3變性高效液相色譜法（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）

DHPLC是利用發生錯配的雜合雙鏈DNA與純合雙鏈DNA解鏈特征的差異將它們分離開來。由于雜合雙鏈DNA錯配位點處氫鍵被破壞而形成“鼓泡”，在部分加熱變性的條件下，更易于解鏈形成Y形結構，與固定相的結合能力降低，所以雜合雙鏈將先于純合雙鏈被洗脫出來，通過洗脫峰的不同就可判斷是否有突變存在。部分研究者也使用了該方法進行CYP2C9及VKORC1的基因突變檢測［32-33］。

與測序法相比，DHPLC簡單、快速、敏感性高，不僅可用于已知突變的檢測，還可以用于未知突變的掃描。但該方法尚未通過大樣本量的驗證，因此目前其臨床應用相對較少。

3　基因分型試劑盒及平臺

基因分型平臺不僅可為華法林的大型臨床研究提供技術支持，也為華法林的臨床應用提供了一定的保障，但基因分型平臺需要較特殊的儀器設備。基因分型試劑盒，由于便于攜帶，操作簡便，可為華法林的臨床應用帶來便利。

3.1目前已獲CFDA批文的CYP2C9及VKORC1基因分型試劑盒

（1）上海百傲科技股份有限公司研發的CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測試劑盒（PCR-芯片雜交法）于2012年獲CFDA批準，是國內首個獲批準的檢測CYP2C9及VKORC1的試劑盒，該試劑盒每次可對12個標本進行基因突變的檢測。

（2）中山大學達安基因股份有限公司的VKORC1和CYP2C9基因檢測試劑盒（PCR-電化學基因芯片法）也于2014年獲CFDA批準，可一次檢測24個標本。

3.2目前已獲FDA及CFDA批文的CYP2C9及VKORC1基因分型平臺

（1）美國TrimGen公司研發的eQ-PCRTMLC華法林基因分型平臺于2009年獲得FDA批準上市，510（k）編碼為k073071，需使用特殊設備LightCycler? Real-TimePCRSysteminstrumentmodel 1.2［34］。

（2）美國ParagonDx有限責任企業研發的可對CYP2C9和VKORC1快速基因分型分析的平臺于2008年獲FDA批準上市，510（k）編碼為k071867，需使用特殊設備Cepheid Smart Cycler Dx［35］。

（3）美國Nanosphere公司研發的Verigene華法林代謝核酸測試系統于2007年獲FDA批準上市，510（k）編碼為k070804，需使用特殊設備The Verigene?System［36］。

（4）美國Osmetech分子診斷公司研發的eSensor?華法林敏感性測試，eSensor?XT-8系統于2008年獲FDA批準上市，510（k）編碼為k073720，需使用特殊設備The eSensor?XT-8 Instrument［37］。

（5）美國GenMark診斷公司研發的eSensor華法林敏感性唾液測試平臺于2011年獲FDA批準上市，510（k）編碼為k110786，需使用特殊設備Oragene·Dx collection device（k110701）models OGD-500，OGD-575，OXD-525 and OYD-500，eSensor?XT-8 Instrument［38］。

（6）美國Autogenomics公司研發的INFINITI 2C9-VKORC1華法林多元檢測技術平臺于2007年獲FDA批準上市，510（k）編碼為k073014，需使用特殊設備Autogenomics INFINITI Analyzer［39］。

（7）佛山達安醫療設備有限公司開發生產的電化學基因芯片檢測儀，于2014年獲CFDA批準，與中山大學達安基因股份有限公司的VKORC1和CYP2C9基因檢測試劑盒配套使用。

4　結語

PCR-RFLP及TaqMan技術由于操作簡單，耗時短，近年被廣泛用于CYP2C9及VKORC1基因突變的檢測。HRM及POCT雖然應用時間較短，但由于其具有高靈敏度、高通量且省時、經濟等優越性，有望成為CYP2C9及VKORC1基因突變檢測的主流方法。MS及DHPLC目前應用于華法林研究尚不多，有待進一步臨床研究加以驗證。

目前用于CYP2C9及VKORC1基因突變檢測的試劑盒較少，國內僅一個試劑盒獲CFDA批準上市。美國FDA已批準一些分型平臺上市，這些分型平臺為華法林的臨床研究和應用奠定了一定的基礎，但這些分型平臺均需要較特殊的儀器設備，尚未得到普遍應用。因此研發高準確性、高靈敏度、簡單、省時、經濟的CYP2C9及VKORC1基因分型平臺及試劑盒，對華法林的臨床研究及使用均具有重要意義。

華法林為抗凝治療的一線藥物，但由于個體差異大，易引起血栓及出血等風險，導致其在中國的使用率非常低。多項研究表明CYP2C9及VKORC1對個體劑量差異有顯著影響，因此有效的基因分型方法對華法林的臨床應用有重要的意義。通過對上述分型方法的分析比較，PCR-RFLP、TaqMan由于操作簡便、省時、且通過了大量研究驗證等特點，均適于臨床推廣應用。HRM由于省時、操作簡便、價格低廉等更突出的優越性，加以大樣本驗證，最適于臨床推廣應用。POCT具備極為省時且操作簡單、準確性高等特點，如果其所需的特殊探針及儀器設備能夠普及，則推薦其大規模臨床應用。

［1］Wadelius M，Chen LY，Lindh JD，et al.The largest prospective warfarin-treated cohort supports geneti forecasting［J］.Blood，2009，113（4）：784-792.

［2］Zhang H，Yang L，Feng Q，et al.Association between VKORC1genepolymorphismsandischemiccerebrovascular disease in Chinese Han population［J］.J Mol Neurosci，2014，53（2）：166-170.

［3］Natarajan S，Ponde CK，Rajani RM，et al.Effect of CYP2C9 and VKORC1 genetic variations on warfarin dose requirements in Indian patients［J］.Pharmacol Rep，2013，65（5）：1375-1382.

［4］Nahar R，Saxena R，Deb R，et al.Pharmacogenetic typing for oral anti-coagulant response among factor V Leiden mutation carriers［J］.Indian J Hum Genet，2012，18（3）：326-331.

［5］Gaikwad T，Ghosh K，Kulkarni B，et al.Influence of CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphisms on warfarin dosage，over anticoagulation and other adverse outcomes in Indian population［J］.Eur J Phar macol，2013，10（1-3）：80-84.

［6］Nahar R，Deb R，Saxena R，et al.Variability in CYP2C9 allele frequency：a pilot study of its predicted impact on warfarin response among healthy South and North Indians［J］.Pharmacol Rep，2013，65（1）：187-194.

［7］余靚平，宋洪濤，曾志勇，等.基于藥物基因組學的華法林給藥模型的驗證［J］.中華心血管病雜志，2012，40（7）：614-619.

［8］Ivashchenko D，Rusin I，Sychev D，et al.The frequency of CYP2C9，VKORC1，and CYP4F2 polymorphisms in Russian patients with high thrombotic risk［J］.Medicina（Kaunas），2013，49（12）：517-521.

［9］Djaffar-Jureidini I，Chamseddine N，Keleshian S，et al. Pharmacogenetics of coumarin dosing：prevalence of CYP2C9 and VKORC1 polymorphisms in the Lebanese population［J］.Genet Test Mol Biomarkers，2011，15（11）：827-830.

［10］Gu Q，Kong Y，Schneede J，et al.VKORC1-1639G＞A，CYP2C9，EPHX1691A＞G genotype，body weight，and age are important predictors for warfarin maintenance doses in patients with mechanical heart valve prostheses in southwest China［J］.Eur J Clin Pharmacol，2010，66（12）：1217-1227.

［11］Sevall JS.Rapid allelic discrimination from real-time DNA amplification［J］.Methods，2001，25（4）：452-455.

［12］Lefferts JA，Schwab MC，Dandamudi UB，et al.Warfarin genotyping using three different platforms［J］.Am J Transl Res，2010，2（4）：441-446.

［13］Klein TE，Altman RB，Eriksson N，et al.Estimation of the warfarin dose with clinical and pharmaco genetic data［J］.N Engl J Med，2009，360（8）：753-764.

［14］婁瑩，韓璐璐，李彥，等.六種基因多態性對中國漢族人群華法林穩定劑量的影響［J］.中華醫學遺傳學雜志，2014，31（3）：367-371.

［15］Botton MR，Bandinelli E，Rohde LE，et al.Influence ofgenetic，biological and pharmacological factors on warfarindoseinaSouthernBrazilianpopulationof European ancestry［J］.Br J Clin Pharmacol，2011，72（3）：442-450.

［16］Yin OQ，Gallagher N，Fischer D，et al.Effects of nilotinibonsingle-dosewarfarinpharmacokineticsand pharmacodynamics：a randomized，single-blind，two-period crossover study in healthy subjects［J］.Clin Drug Investig，2011，31（3）：169-179.

［17］Mazzaccara C，Conti V，Liguori R，et al.Warfarin anticoagulant therapy：a southern Italy pharmaco geneticsbased dosing model［J］.Plos One，2013，8（8）：1-8.

［18］You JH，Wong RS，Waye MM，et al.Warfarin dosing algorithm using clinical，demographic and phar macogenetic data from Chinese patients［J］.J Thromb Thrombolysis，2011，31（1）：113-118.

［19］King CR，Porche-Sorbet RM，Gage BF，et al.Performance of commercial platforms for rapid genotyping of polymorphisms affecting warfarin dose［J］.Am J Clin Pathol，2008，129（6）：876-883.

［20］施宏，虞閏六，馬金飛，等.單管PCR-Pyrosequencing快速檢測華法林代謝酶基因多態性的建立［J］.遺傳，2011，33（11）：1283-1290.

［21］Okada Y，Nakamura K，Adachi A，et al.Development of a single-tube PCR-pyrosequencing method for the simultaneous and rapid detection of four variant alleles of CYP2C9 gene polymorphism［J］.J C lin Pharm Ther，2008，33（2）：187-192.

［22］Kim KA，Song WG，Lee HM，et al.Multiplex pyrosequencing method to determine CYP2C9*3，VKORC1*2，and CYP4F2*3 polymorphisms simultaneously：its application to a Korean population and comparisons with other ethnic groups［J］.Mol Biol Rep，2014，41（11）：7305-7312.

［23］Zhou L，Myers AN，Vandersteen JG，et al.Closed-tube genotyping with unlabeled oligonucleotide probes and a saturating DNA dye［J］.Clin Chem，2004，50（8）：1328-1335.

［24］崔廣林，丁虎，徐宇軍，等.高分辨率熔解曲線方法在指導華法林使用起始劑量基因分型中的應用及臨床各種基因分型方法的比較［J］.中華心血管病雜志，2012，40（6）：477-481.

［25］莊文芳，吳德沛，王兆鉞.上海地區服用華法林人群相關基因型及非遺傳因素對用藥劑量的影響［J］.中華血液學雜志，2014，35（1）：13-17.

［26］Chen C，Li S，Lu X，et al.High resolution melting method to detect single nucleotide polymorphism of VKORC1 and CYP2C9［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014， 7（5）：2558-2564.

［27］van Schie RM，Wadelius MI，Kamali F，et al.Genotype-guided dosing of coumarin derivatives：the E uropean pharmacogenetics of anticoagulant therapy（EUPACT）trial design［J］.Pharmacogenomics，2009，10（10）：1687-1695.

［28］Howard R，Leathart JB，French DJ，et al.Genotyping for CYP2C9 and VKORC1 alleles by a novel point of care assay with HyBeacon probes［J］.Clin Chim Acta，2011，412（23-24）：2063-2069.

［29］Pirmohamed M，Burnside G，Eriksson N，et al.A randomized trial of genotype-guided dosing of warfarin［J］. N Engl J Med，2013，369（24）：2294-2303.

［30］Carlquist JF，McKinney JT，Nicholas ZP，et al.Rapid melting curve analysis for genetic variants that underlie inter-individual variability in stable warfarin dosing［J］. J Thromb Thrombolysis，2008，26（1）：1-7.

［31］Yang S，Xu L，Wu HM.Rapid genotyping of single nucleotide polymorphisms influencing warfarin drug response by surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight（SELDI-TOF）mass spectrometry［J］. J Mol Diagn，2010，12（2）：162-168.

［32］黃盛文，向道康，吳海麗，等.五種基因多態性對華法林用量個體差異影響的研究［J］.中華醫學遺傳學雜志，2011，28（6）：661-665.

［33］Huang SW，Chen HS，Wang XQ，et al.Validation of VKORC1 and CYP2C9 genotypes on interindividual warfarin maintenance dose：a prospective study in Chinese patients［J］.Pharmacogenet Genomics，2009，19（3）：226-234.

［34］Howard D.510（k）summary［EB/OL］.http：//www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf7/k073071，2009-02-06/ 2014-12-21.

［35］Deborah K.510（k）summary［EB/OL］.http：//www. accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf7/k071867，2008-04-28/ 2014-12-21.

［36］Sue K.510（k）summary［EB/OL］.http：//www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf7/k070804，2007-09-17/2014-12-21.

［37］Robert D.510（k）summary［EB/OL］.http：//www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf7/k073720，2008-07-17/2014 -12-21.

［38］John R.510（k）summary［EB/OL］.http：//www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf11/k110786，2011-12-02/2014 -12-21.

［39］Evelyn L.510（k）summary［EB/OL］.http：//www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf7/k073014，2008-01-28/2014 -12-21.

The overview of warfarin related gene mutation detection technologies

SUN Xue1，2，KUANG Yun1，2，YANG Xiding1，2，GUO Chengxian2，YANG Guoping2★
（1.Pharmaceutical College of Central South University，Changsha，Hunan，China，410013；2.Center of Clinical Pharmacology，the Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan，China，410013）

Warfarin is a kind of commonly prescribed oral anticoagulant for preventing thromboembolic disease.However，it is prone to cause thromboembolism or bleeding due to its narrow therapeutic window. The predominant polymorphisms in CYP2C9 and VKORC1 genes，encoding for metabolizing enzyme cytochrome P450 2C9（CYP2C9）and target enzyme vitamin K epoxide reductase complex subunit 1（VKORC1），have significant impact on individual differences in dose requirement.So the detection of CYP2C9 and VKORC1 mutation has important reference value to individualized therapy.At present，the usually detection methods of CYP2C9 and VKORC1 include PCR-RFLP，TaqMan，pyrosequencing，HRM，POCT，melting curve analysis，MS，DHPLC，and so on.The characteristics of these detection methods will be compared in this article to find out the most suitable technical detection methods for clinical application and promotion.

Warfarin；CYP2C9；VKORC1；Gene mutation detection

科技部國際科技合作與交流專項（2014DFA30900）；國家自然科學基金（81373476）

1.中南大學藥學院，湖南，長沙410013 2.中南大學湘雅三醫院臨床藥理中心，湖南，長沙410013

陽國平，E-mail：ygp9880@163.com