抗FOC4香蕉內(nèi)生放線菌的篩選及菌株NJQG—3A1鑒定

胡一鳳+井濤+王夢(mèng)穎+等

摘要：以海南臨高和皇桐2地采集的3個(gè)品種（系）健康和已感染枯萎病的香蕉植株為樣品，采用組織勻漿法進(jìn)行內(nèi)生放線菌的分離，共獲得內(nèi)生放線菌142株，并以尖孢鐮刀菌4號(hào)生理小種為靶標(biāo)菌株，通過平板對(duì)峙試驗(yàn)，篩選出6株抗性菌株，其中分離得到的NJQG-3A1菌株對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，抑制率可達(dá)83.21%。對(duì)菌株NJQG-3A1進(jìn)行形態(tài)與生理生化特征、16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹比對(duì)分析，結(jié)果表明，菌株NJQG-3A1為Streptomyces phaeoluteichromatogennes，其發(fā)酵液對(duì)溫室盆栽香蕉枯萎病的相對(duì)防效可達(dá)82.46%，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎病；內(nèi)生放線菌；分離鑒定；拮抗；菌株NJQG-3A1

中圖分類號(hào)： S436.68+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0127-05

收稿日期：2013-12-10

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-32）。

作者簡(jiǎn)介：胡一鳳（1984—），女，碩士，從事香蕉枯萎病防控研究。E-mail：sunmoonfeng@126.com。

通信作者：黃綿佳，教授，從事植物生理研究，E-mail：hmj886@163.com；張錫炎，研究員，從事香蕉枯萎病防治研究，E-mail：zxyan1981@163.com。香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，F(xiàn)OC ）侵染維管束而引起壞死的一種毀滅性真菌性病害，近年來(lái)我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)深受其害，華南地區(qū)尤其嚴(yán)重[1-2]。目前，生產(chǎn)上還未見對(duì)香蕉枯萎病有效的化學(xué)藥劑[3-4]，且農(nóng)藥殘留還會(huì)帶來(lái)一系列環(huán)境污染問題[5-6]，運(yùn)用生物防治方法對(duì)香蕉枯萎病進(jìn)行綜合防控已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[7]。放線菌在病害防治、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量等方面起到重要作用，正在被人們?cè)絹?lái)越多地開發(fā)和應(yīng)用[8-9]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道多種香蕉枯萎病的拮抗微生物，但這些微生物大部分都是從植株體外的環(huán)境中分離篩選得到的[10-11]，在香蕉體內(nèi)定殖能力較弱，嚴(yán)重影響防控效果[12]。從植物內(nèi)生菌中篩選生防菌，可以防治植物病害、克服定殖障礙，使生物防治保持長(zhǎng)期的效果[13]。本研究以尖孢鐮刀菌4號(hào)生理小種（FOC4）為靶標(biāo)菌，對(duì)香蕉植株進(jìn)行放線菌分離篩選，并通過盆栽試驗(yàn)檢測(cè)拮抗菌株對(duì)香蕉枯萎病的防控效果，以期篩選出對(duì)防控香蕉枯萎病具有應(yīng)用前景的內(nèi)生放線菌。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病原菌尖孢鐮刀菌4號(hào)生理小種，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所曾會(huì)才實(shí)驗(yàn)室提供。1.1.2主要培養(yǎng)基內(nèi)生放線菌分離培養(yǎng)基采用改良高氏（Gauses）1號(hào)培養(yǎng)基（GS）、1/10 ATCC 合成培養(yǎng)基、葡萄糖天門冬酸培養(yǎng)基（GA）、腐殖酸培養(yǎng)基（HV）、改良高氏2號(hào)培養(yǎng)基（GPT）和改良淀粉酪素培養(yǎng)基（SIM）[14-18]，為抑制雜菌生長(zhǎng)，在各分離培養(yǎng)基中均加入終濃度為75 mg/L的重鉻酸鉀、100 mg/L的制霉菌素和20 mg/L的萘啶酮酸[18]；放線菌純化培養(yǎng)保存采用YE培養(yǎng)基[15]；抑菌試驗(yàn)采用馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；液體發(fā)酵采用淀粉-大豆粉液體培養(yǎng)基[17]；形態(tài)特征觀察采用國(guó)際鏈霉菌計(jì)劃（ISP）推薦的培養(yǎng)基，參考Shirling等的方法[19-20 ]進(jìn)行配制。

1.1.3樣品采集與處理2012年11月3日從海南省臨高南寶蕉園（ 19°47′1″N， 109°51′17″E）和皇桐蕉園（ 19°49′58″N， 109°50″E）采集香蕉植株樣品（表1）。每個(gè)品種隨機(jī)采集香蕉植株10株，混勻。

表1樣品采集信息

采集地點(diǎn)根部土壤

pH值香蕉植株采集植株部位皇桐美臺(tái)蕉園4.35農(nóng)科健康植株（NK）根、球莖、假莖、葉臨高南寶蕉園4.17南天健康植株（NJ）根、球莖、假莖、葉臨高南寶蕉園5.54南天感病植株（NB）根、球莖、假莖、葉臨高南寶蕉園4.17巴西健康植株（BJ）根、球莖、假莖、葉臨高南寶蕉園5.54巴西感病植株（BB）根、球莖、假莖、葉

1.2方法

1.2.1內(nèi)生放線菌的分離參考阮繼生分離弗蘭克氏菌的方法[21]對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒，采用組織塊勻漿法[22]進(jìn)行內(nèi)生放線菌分離。

1.2.2香蕉枯萎病內(nèi)生拮抗放線菌篩選以尖孢鐮刀菌4號(hào)生理小種（FOC4）為靶標(biāo)菌，采用平板對(duì)峙法進(jìn)行初篩；對(duì)初篩有活性的菌株用平板對(duì)峙法進(jìn)行復(fù)篩，計(jì)算抑菌率，公式為：抑菌率=[（對(duì)照組菌落半徑-處理組菌落半徑）/對(duì)照組菌落半徑]×100%。采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncans多重比較。

1.2.3拮抗菌株發(fā)酵液對(duì)FOC4的抑菌活性拮抗菌株接種于大豆粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)7 d；取發(fā)酵液50 mL，離心，用微孔濾膜過濾上清液除菌；采用含藥介質(zhì)法，將1 mL活性菌株濾液與9 mL熔融態(tài)的PDA培養(yǎng)基混合均勻倒平板；冷卻，接種直徑為6 mm的 FOC4靶標(biāo)菌于平板中央。以等量大豆粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基直接發(fā)酵培養(yǎng)的上清液倒平板、接種FOC4靶標(biāo)菌為對(duì)照。每處理重復(fù)3次，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，計(jì)算抑菌率。

以無(wú)菌水沖洗、收集FOC4孢子，并稀釋成濃度為1×106 CFU/mL的孢子懸浮液；把活性菌株發(fā)酵濾液與FOC4孢子懸浮液等體積混合均勻，置于無(wú)菌濾紙片保濕的凹玻片內(nèi)，28 ℃、相對(duì)濕度80%的人工氣候箱中光照培養(yǎng)24 h；取出玻片，以孢子萌發(fā)的芽管長(zhǎng)度達(dá)到或超過孢子半徑定為萌發(fā)[23]，在顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算各處理孢子萌發(fā)抑制率，公式為：孢子萌發(fā)抑制率=[（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率]×100%。以大豆粉液體培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

1.2.4拮抗菌株對(duì)香蕉枯萎病的防效采用盆栽試驗(yàn)，共設(shè)3個(gè)處理：處理1：不接種FOC4病原菌和NJQG-3A1拮抗菌，使用等量的清水；處理2：接種FOC4病原菌，不接種 NJQG-3A1 拮抗菌；處理3：接種FOC4病原菌和NJQG-3A1拮抗菌株。接種用的病原菌27 ℃、120 g/min PDA培養(yǎng)液上搖瓶培養(yǎng)6 d，勻漿，稀釋成106 CFU/mL量級(jí)的病原菌孢子懸浮液；除去香蕉杯苗根部的營(yíng)養(yǎng)土，處理2和處理3傷根，浸泡在病原菌孢子懸浮液中30 min；蕉苗移栽到盆中，處理3用拮抗菌發(fā)酵液進(jìn)行灌根處理，處理1、處理2灌入等量清水，每次澆灌200 mL，每隔7 d 澆灌1次，共計(jì)7次；香蕉杯苗移栽后48 d，觀察記錄香蕉植株葉片及根莖部枯萎病發(fā)病情況，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照方中達(dá)等的方法[24]，進(jìn)行病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)。在整個(gè)盆栽期間，各處理其他管理措施一致。

1.2.5活性菌株鑒定形態(tài)特征觀察采用平板插片法[14]。將菌株接種在改良高氏1 號(hào)固體培養(yǎng)基上做插片，掃描電鏡觀察其形態(tài)特征；培養(yǎng)特征觀察參照《放線菌的分類和鑒定》和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》的方法[23，25]；生理生化特征參照 Shirling 等的方法[19-20]進(jìn)行鑒定。

采用16S rRNA基因序列分析活性菌株。用溶液型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒法提取活性菌株基因組DNA，試劑盒購(gòu)買于北京百泰克生物技術(shù)有限公司。根據(jù)放線菌的16S rRNA基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和保守區(qū)，采用通用引物進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，通用引物27F、1492R購(gòu)于上海生物工程公司，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約1 400 bp，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反應(yīng)體系為25 μL：模板1 μL、引物1492R 1 μL、引物27F 1 μL、PCR Mix 12 μL、ddH2O 10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，序列通過EzTaxon 在線比對(duì)服務(wù)（http：//www. eztaxon.org/）進(jìn)行相關(guān)有效種的相似性搜索，下載相似性較高的放線菌16S rRNA基因序列用Clustal X 1.8軟件進(jìn)行序列比對(duì)，用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生放線菌的分離

將印跡平板于28 ℃下培養(yǎng)14 d，觀察到無(wú)菌生長(zhǎng)，證實(shí)從香蕉樣品中共分離得到的142株代表菌株均為內(nèi)生放線菌。由圖1可見，在抗病品種南天健康植株中分離得到的內(nèi)生放線菌最多，共計(jì)51株，其次是巴西健康植株，為49株，最少是巴西感病植株，為7株；不同品種香蕉植株內(nèi)生放線菌分離呈現(xiàn)南天健康植株（NJ）>巴西健康植株（BJ）>農(nóng)科健康植株（NK）>南天感病植株（NB）>巴西感病植株（BB）的規(guī)律，健康株內(nèi)生放線菌遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于感病植株。

由圖2可見，各組織中內(nèi)生放線菌分離數(shù)量，呈現(xiàn)根>球莖>假莖>葉的規(guī)律；根分離的內(nèi)生放線菌最多，為68株，其次是球莖，為58株，葉中最少，僅6株；香蕉植株根與球莖共分離126株內(nèi)生放線菌，假莖與葉共分離16株，地下部位組織分離內(nèi)生放線菌的菌株數(shù)大于地上部組織。由圖3可見，巴西健康植株各組織均有內(nèi)生放線菌的分布，而巴西感病植株體內(nèi)內(nèi)生放線菌分布比較單一。

由圖4可見，腐殖酸培養(yǎng)基分離的內(nèi)生放線菌最多，為62株；改良高氏2號(hào)培養(yǎng)基分離的內(nèi)生放線菌最少，為4株；6種選擇培養(yǎng)基分離內(nèi)生放線菌菌株數(shù)量由多到少的次序?yàn)椋焊乘崤囵B(yǎng)基（HV）﹥葡萄糖天門冬酸培養(yǎng)基（GA）﹥改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基（GS）﹥改良高氏2號(hào)培養(yǎng)基（GPT）﹥1/10 ATCC合成培養(yǎng)基﹥改良淀粉酪素培養(yǎng)基（SIM）。

2.2內(nèi)生拮抗放線菌的篩選

以FOC4為檢測(cè)菌，經(jīng)初篩和復(fù)篩，共篩選出6株拮抗效果較好的放線菌，占分離株數(shù)的4.23%，其中，菌株 NJQG-3A1 活性最強(qiáng)，對(duì)FOC4抑菌率可達(dá)83.21%（表2）。

2.3活性菌株NJQG-3A1發(fā)酵液對(duì)FOC4的抑菌效果

經(jīng)含藥介質(zhì)法檢測(cè)，結(jié)果顯示，菌株NJQG-3A1發(fā)酵液

表2復(fù)篩菌株對(duì)FOC4的抑菌效果

菌株菌落半徑

（cm）抑菌率

（%）NJQG-3A10.47±0.03383.21ABJQG-A31.00±0.11564.29BBJQG-1211.13±0.03359.64BNJGg-A41.23±0.06756.07BCBJQG-12 1.13±0.03359.64BNBGH-F1.63±0.18641.79CCK2.80±0.1000 D注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示數(shù)據(jù)間有極顯著性差異（P<0.01）。

對(duì)FOC4菌絲生長(zhǎng)的抑制率為90.74%（圖5）。由圖6可見，對(duì)照組的FOC4孢子完全萌發(fā)，NJQG-3A1發(fā)酵液對(duì)FOC4孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到100%。

2.4活性菌株NJQG-3A1對(duì)香蕉枯萎病的防控效果

由表3可見，接種病原菌和NJQG-3A1發(fā)酵液（處理3）的香蕉植株，其病情指數(shù)為15.00，對(duì)香蕉枯萎病相對(duì)防效為82.46%，菌株NJQG-3A1對(duì)香蕉枯萎病具有良好的防控作用，與僅接種病原菌（處理2）相比，差異極為顯著。

表3菌株NJQG-3A1對(duì)香蕉枯萎病病盆栽防治效果

不同處理發(fā)病率

（%）病情指數(shù)相對(duì)防效

（%）處理1（清水）5.005.0094.15處理2（病原菌）100.0085.500處理3（病原菌+發(fā)酵液）15.0015.0082.46

2.5活性菌株NJQG-3A1的鑒定結(jié)果

從形態(tài)特征上看，菌株NJQG-3A1在高氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，菌落呈圓餅粉狀，氣生菌絲為白色，基內(nèi)菌絲不發(fā)達(dá)，白色細(xì)絲狀。電鏡下掃描可以看到，緊密排列的孢子絲有較少分叉，孢子鏈螺旋狀排列，單個(gè)成熟的孢子呈棒桿狀，表面微絨（圖7）。

由表4可見，菌株NJQG-3A1在7種鑒定培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)；在酵母膏麥芽汁瓊脂、燕麥片瓊脂、胨酵母膏鐵瓊脂培養(yǎng)基上較其他培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，產(chǎn)孢多，且有可溶性色素產(chǎn)生；在甘油天門冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基上無(wú)基內(nèi)菌絲；在不同培養(yǎng)基上，基內(nèi)菌絲呈現(xiàn)出白色、黃褐色、棕色等，氣生菌絲主要為白色至棕色、黃褐色等。

生理生化特征分析結(jié)果表明，菌株NJQG-3A1明膠液化，不產(chǎn)黑色素，淀粉水解，不產(chǎn)H2S；在吲哚試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、脂酶試驗(yàn)與硝酸還原試驗(yàn)中均顯陽(yáng)性；可以利用的碳源有核糖、可溶性淀粉、水楊苷、葡萄糖、蔗糖、肌醇等，可以利用的氮源有纈氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、組氨酸、絲氨酸等；最適生長(zhǎng)pH值為7.0～8.0，最適生長(zhǎng)溫度28～30 ℃；NaCl受耐性為3%。表4菌株NJQG-3A1在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征

培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況氣生菌絲基內(nèi)菌絲可溶性色素高氏1號(hào)培養(yǎng)基生長(zhǎng)慢，產(chǎn)孢少適中、白色白色無(wú)酵母膏麥芽汁瓊脂生長(zhǎng)快，產(chǎn)孢多豐富、白色至灰棕色黃褐色黃褐色無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂生長(zhǎng)慢，產(chǎn)孢少適中、白色至棕褐色棕色無(wú)燕麥片瓊脂生長(zhǎng)快，產(chǎn)孢多豐富，白色至灰棕色黃褐色淡黃色甘油天門冬酰胺瓊脂生長(zhǎng)慢，產(chǎn)孢少少，黃棕色無(wú)無(wú)胨酵母膏鐵瓊脂生長(zhǎng)快，產(chǎn)孢多豐富，灰白色至黃褐色黃褐色黃褐色酪氨酸瓊脂生長(zhǎng)慢，產(chǎn)孢少少，白色至黃褐色灰白色無(wú)

以菌株NJQG-3A1基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)得菌株NJQG-3A1 16S rRNA基因核苷酸序列長(zhǎng)度為 1 421 bp，序列提交GenBank，獲得登錄號(hào)為KF703553，在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)有效種的序列相似性搜索，發(fā)現(xiàn)與菌株NJQG-3A1相似性較高的都是鏈霉菌屬成員，其中，與Streptomyces phaeoluteichromatogenes NRRL 5799T相似性最高，達(dá)到99.221%。采用BioEdit、Mega 6.0等軟件對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并用鄰接法（Neighbour-Joining，NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8）。綜合菌株NJQG-3A1的培養(yǎng)特征和生理生化特征，將其鑒定為Streptomyces phaeoluteichromatogenne。

3結(jié)論與討論

本研究在6種分離培養(yǎng)基上，采用組織勻漿法從5種香蕉植株體內(nèi)共分離到142株內(nèi)生放線菌，經(jīng)平板對(duì)峙試驗(yàn)，篩選出6株對(duì)FOC4具有抑制作用的活性菌株，其中，活性菌株NJQG-3A1對(duì)FOC4的抑制作用最強(qiáng)，抑菌率達(dá)83.21%，盆栽防效達(dá)82.46%。

從植物組織內(nèi)分離到的內(nèi)生菌數(shù)量和種類受很多因素的影響，如分離材料的來(lái)源、分離的組織部位、分離方法、分離培養(yǎng)基的成分、表面消毒程度及培養(yǎng)條件等，目前還沒有一種完全適用的方法可以分離植物組織內(nèi)的所有微生物，通過選擇適宜的分離方法，可以盡可能多地獲得內(nèi)生菌。研究結(jié)果表明：（1）香蕉植株各個(gè)組織中都存在大量的內(nèi)生放線菌，內(nèi)生放線菌數(shù)量在香蕉組織內(nèi)呈現(xiàn)根>球莖>假莖>葉的趨勢(shì)，這與曹理想等的結(jié)果[26]相同。這一方面是由于內(nèi)生微生物主要是通過根進(jìn)入植株體內(nèi)[27]，從而在根部分離得到的內(nèi)生放線菌相對(duì)較多；另一方面可能是在植物內(nèi)生菌分離的實(shí)際操作中，次氯酸鈉、乙醇等常用消毒劑對(duì)內(nèi)生菌有很大的殺傷作用[28]，且消毒時(shí)間和消毒方式也會(huì)影響分離結(jié)果[26]，香蕉葉片組織表皮較薄，消毒時(shí)間過長(zhǎng)，一部分內(nèi)生菌可能會(huì)被殺死，從而導(dǎo)致在葉中分離到的內(nèi)生放線菌數(shù)量少。（2）從健康植株分離得到的內(nèi)生放線菌遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于病株，這與林時(shí)遲等的研究結(jié)論[29]相符，植物體內(nèi)微生物種群越豐富，數(shù)量越多，植物生態(tài)系的功能與結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，越不易感病。（3）從南寶蕉園南天植株內(nèi)分離得到63株內(nèi)生放線菌，而從黃桐美臺(tái)蕉園農(nóng)科植株體內(nèi)分離到23株，這可能是受土壤環(huán)境差異影響，南寶蕉園土壤的pH值明顯高于黃桐美臺(tái)蕉園，土壤相對(duì)偏堿性，堿性條件適合于放線菌的生存[30]。（4）HV和GA培養(yǎng)基上分離得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量分別為62株和40株，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于從GS、SIM、1/10ATCC、GPT培養(yǎng)基上得到的內(nèi)生放線菌數(shù)量，這說明前2種培養(yǎng)基比較適合香蕉內(nèi)生放線菌的分離。（5）通過平板對(duì)峙、含藥介質(zhì)法及孢子萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)活性菌株NJQG-3A1對(duì)FOC4具有明顯的抑制作用，為香蕉內(nèi)生放線菌抗菌活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供了一定的理論與應(yīng)用基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)由于受到分離手段的局限性，有些內(nèi)生菌不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，有些內(nèi)生菌因?yàn)樯L(zhǎng)緩慢而被生長(zhǎng)相對(duì)較快的菌株所掩蓋，沒有獲得稀有的放線菌，在一定程度上減少了活性菌株的發(fā)現(xiàn)概率。此外，本研究主要在室內(nèi)離體條件下進(jìn)行，若要更準(zhǔn)確地探究拮抗菌株NJQG-3A1的生防潛能，需要對(duì)該菌株抑菌活性進(jìn)行更深層次的綜合評(píng)價(jià)。

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