假臭草殺蟲成分的微波輔助提取及生物活性

李水清　張琳琳

摘要：在微波加熱條件下，以石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇為溶劑對假臭草葉干粉進行提取，研究了上述溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲的觸殺、胃毒及拒食活性的影響。研究結(jié)果表明，各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲均具有一定的觸殺、胃毒和拒食活性，其中以乙醇提取物的觸殺作用最強，處理后48 h的校正死亡率達到39.22%；丙酮提取物的胃毒活性和拒食活性最強，處理48、72 h后分別達到 45.27%、46.67%。

關(guān)鍵詞：：假臭草；蓼藍齒脛葉甲；觸殺；胃毒；拒食

中圖分類號：S482.3+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0136-03

收稿日期：2014-03-09

基金項目：湖北省教育廳科研項目（編號：Q200712003）；長江大學博士科研基金。

作者簡介：李水清（1969—），男，湖北仙桃人，博士，教授，從事化學生態(tài)學和害蟲綜合治理研究。E-mail：shuiqing2000@163.com。假臭草（Eupatorium catarium）是菊科澤蘭屬一年生草本植物。在國內(nèi)，假臭草于20世紀80年代在香港首次被發(fā)現(xiàn)，但一直被誤認為是熊耳草（Ageratum houstonianum Mill），直到1995年才被鑒定。上世紀90年代假臭草開始在深圳出現(xiàn)，現(xiàn)在已經(jīng)占領(lǐng)了廣東、福建、澳門、香港、臺灣、海南等沿海地區(qū)大部分荒坡、荒地、灘涂、林地、果園。由于假臭草對土壤肥力的吸收力強，會極大地消耗土壤養(yǎng)分，因此對土壤可耕性的破壞極為嚴重，嚴重影響林木的生長[1-2]。假臭草含有許多具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物，如鄧世明等從假臭草的70%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物中分離得到5種黃酮化合物[3]。假臭草揮發(fā)油對許多植物種子萌發(fā)和生長具有抑制作用，如鄧世明等研究表明高濃度的假臭草超聲提取液能顯著抑制小粒的種子萌發(fā)，抑制植物幼根的生長[4]；林成俊等在假臭草中分離、鑒定出一種全順-環(huán)己烷-1，2，4-三醇的物質(zhì)，該物質(zhì)能抑制蘿卜和小白菜種子的萌發(fā)[5]。假臭草的揮發(fā)油還能對昆蟲和真菌能產(chǎn)生忌避或抑制作用[4]，如假臭草的甲醇與乙醇的提取物均對螺旋粉虱成蟲、荔枝粗脛翠尺蛾具有較強的殺蟲活性和拒食活性[7-8]，岑伊靜等發(fā)現(xiàn)假臭草揮發(fā)油對柑橘木虱成蟲也有顯著的驅(qū)避作用[9]。本試驗在微波加熱條件下，以石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇為溶劑分別對假臭草中的生物活性物質(zhì)進行提取，并研究了各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲的觸殺、胃毒及拒食活性的影響，旨在為充分利用植物資源、開發(fā)與環(huán)境相適應的生物農(nóng)藥提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料野生假臭草采自長江大學周邊，洗凈，取其葉，自然風干，然后在60 ℃恒溫干燥箱中干燥8 h，粉碎，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2供試昆蟲蓼藍齒脛葉甲（Gastrolphysa atrocyanea）幼蟲，采集于荊州護城河畔皺葉酸模上，室內(nèi)飼養(yǎng)后挑選整齊一致的幼蟲供試。室內(nèi)飼養(yǎng)條件：溫度（27±1） ℃，空氣相對濕度（80±5）%，光-暗周期14 h-10 h。

1.1.3主要儀器微電腦微波化學反應器WBFY-201（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱、QHX-250BS-Ⅲ人工氣候箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.1.4化學試劑石油醚、乙酸乙酯（分析純，天津市福晨化學試劑廠），三氯甲烷、丙酮（分析純，武漢市中天化工有限責任公司），乙醇（分析純，安徽安特生物化學有限公司）；瓊脂粉（化學純，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）；十二烷基磺酸鈉（分析純，天津市光復精細化工研究所）。

1.2方法

1.2.1微波輔助提取準確稱取10 g假臭草葉干粉，分為5 份，分別放入 100 mL圓底燒瓶中，往燒瓶中分別加入 40 mL石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚。將燒瓶放入微電腦微波化學反應器中，并安裝好冷凝裝置，提取5 min。將提取液減壓抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至稠膏狀為止。將稠膏狀提取物用丙酮稀釋后轉(zhuǎn)入 50 mL容量瓶中，加入10 mL 0.1% 十二烷基磺酸鈉，配制成40 mg/mL的丙酮溶液，供試。

1.2.2觸殺活性的測定采用點滴法[10]，即將各溶劑提取物用微量點滴器點滴于試蟲的前胸背板，每蟲點滴1 μL，以用0.1%十二烷基磺酸鈉水溶液稀釋后的丙酮溶液為對照。處理后的幼蟲置于培養(yǎng)皿（內(nèi)墊濾紙，加少許蒸餾水保濕）中，每皿接入大小基本一致的蓼藍齒脛葉甲幼蟲20頭，以保鮮膜封口，膜上打孔以利通風透氣，每個處理重復3 次。于處理后12、24、36、48 h后分別檢查并記錄死亡情況。以毛筆尖碰觸幼蟲腹部的末端，頭部不能擺動，身體不能向前爬行判為死亡的標記。計算死亡率、校正死亡率，用DPS軟件分析數(shù)據(jù)。

死亡率=死蟲數(shù)/供試蟲數(shù)×100%；

校正死亡率=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100%。

1.2.3胃毒活性的測定采用帶毒夾片法[11]，即取皺葉酸模葉片，洗凈后，用直徑3.0 cm的打孔器打成直徑為3.0 cm的葉碟，取2片同樣大小的皺葉酸模葉碟，在其中一片的背面用醫(yī)用脫脂棉均勻涂抹不同溶劑的假臭草提取液（40 mg/mL），在另一片的正面涂上瓊脂（瓊脂粉加水煮沸調(diào)配而成），迅速將2片葉碟對合，制成帶毒夾片。將帶毒夾片置于培養(yǎng)皿（內(nèi)墊濾紙，加少許蒸餾水保濕）中，每皿放8個帶毒夾片，接入大小基本一致的蓼藍齒脛葉甲幼蟲20頭。以保鮮膜封口，膜上打孔以利通風透氣。以用0.1%十二烷基磺酸鈉水溶液稀釋后的丙酮溶液為溶劑對照，每個處理重復3次。于處理24、48、60、72 h后后分別檢查并記錄蓼藍齒脛葉甲幼蟲死亡情況，計算死亡率、校正死亡率。

1.2.4拒食活性的測定采用小葉碟法[12]，即取皺葉酸模葉片，洗凈后用直徑1.5 cm的打孔器打成直徑為1.5 cm的葉碟，分別浸漬于不同溶劑的假臭草提取液（40 mg/mL）中3 s，取出后用吸水紙吸取葉碟邊緣的多余藥液，放入培養(yǎng)皿（內(nèi)墊濾紙，加少許蒸餾水保濕）中，每皿放50片葉碟，接入20只試蟲。以保鮮膜封口，膜上打孔以利通風透氣。以用0.1%十二烷基硫酸鈉水溶液稀釋后的丙酮溶液為溶劑對照，每個處理重復3次。于處理12、24、36、48 h后分別調(diào)查取食情況，計算取食指數(shù)和拒食率。按下面的分級標準及公式統(tǒng)計計算。

零級：無取食痕跡；Ⅰ級：零星取食；Ⅱ級：有明顯取食缺刻；Ⅲ級：取食面積約占1/3；Ⅳ級：取食面積約占1/2；Ⅴ級：取食面積約占3/4；Ⅵ級：僅留下少量殘渣。

取食指數(shù)=∑（危害級別×各級葉碟數(shù)）總?cè)~碟數(shù)×最高級別×參試總蟲數(shù)×100%；

拒食率=對照取食指數(shù)-處理取食指數(shù)對照取食指數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1假臭草各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲的觸殺活性

微波加熱條件下，假臭草各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲的觸殺活性見表1。從表1可看出，在微波輔助加熱條件下，5種溶劑的假臭草提取物在濃度為 40 mg/mL時， 對蓼

表1假臭草各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲觸殺活性的影響

藍齒脛葉甲幼蟲均有一定的觸殺活性。處理12、24、36、48 h后，均以乙醇提取物的觸殺活性最強，與其他幾種溶劑提取物相比，觸殺活性存在顯著差異，而石油醚提取物的觸殺活性最弱。此外，隨時間的增加，各溶劑提取物的觸殺活性均有增強趨勢。

2.2假臭草各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲的胃毒活性

假臭草各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲的胃毒活性見表2。由表2可看出，5種溶劑的假臭草提取物在濃度為 40 mg/mL，處理24、48、60、72 h后均對蓼藍齒脛葉甲幼蟲表現(xiàn)一定的胃毒活性，以丙酮提取物的胃毒活性最強，處理后 72 h 校正死亡率為46.67%。

表2假臭草各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲胃毒活性的影響

2.3假臭草各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲的拒食活性

假臭草各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲的拒食活性見表3。從表3可看出，假臭草的丙酮提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲的拒食活性最強。

3結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，在微波輔助加熱條件下，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醇的假臭草葉提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲均表現(xiàn)出一定的觸殺、胃毒和拒食活性。其中，以乙醇提取物的觸殺作用最強，而丙酮提取物的胃毒活性和拒食活性最強。今后將對假自草乙醇和丙酮提取物進行分離、提純，鑒定出具有殺蟲活性的物質(zhì)，開發(fā)與環(huán)境相適應的植物源農(nóng)藥。

表3假臭草各溶劑提取物對蓼藍齒脛葉甲幼蟲拒食活性的影響

參考文獻：

[1]Huang Q Q，Wu J M，Bai Y Y，et al. Identifying the most noxious invasive plants in China：role of geographical origin，life form and means of introduction[J]. Biodiversity and Conservation，2009，18（2）：305-316.

[2]Weber E，Sun S G，Li B. Invasive alien plants in China：diversity and ecological insights[J]. Biological Invasions，2008，10（8）：1411-1429.

[3]鄧世明，楊先會，王 寧，等. 外來入侵植物假臭草的黃酮類成分研究[J]. 西北植物學報，2009，29（12）：2548-2550.

[4]鄧世明，王寧，湯麗昌，等. 外來入侵植物假臭草的化感作用研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2010，26（16）：277-280.

[5]林成俊，郭煥佳，龐淇尹. 入侵植物假臭草化感物質(zhì)的分離及鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36（9）：3497-3498.

[6]王真輝，安鋒，陳秋波. 外來入侵雜草——假臭草[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學，2006，26（6）：33-37.

[7]鐘寶珠，呂朝軍，孫曉東，等. 青葙提取物對螺旋粉虱的殺蟲活性研究[J]. 熱帶作物學報，2010，31（11）：2025-2029.

[8]成家寧，陳炳旭，曾鑫年，等. 14種植物乙醇提取物對荔枝粗脛翠尺蛾成蟲產(chǎn)卵和幼蟲取食的影響[J]. 果樹學報，2011，28（2）：290-295.

[9]岑伊靜，葉峻銘，徐長寶，等. 柑橘木虱對幾種非嗜食植物揮發(fā)油的趨性反應測定[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學學報，2005，26（3）：41-44.

[10]慕立義. 植物化學保護研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994：54-60.

[11]吳文君. 植物化學保護實驗技術(shù)導論[M]. 西安：陜西科學技術(shù)出版社，1988：43-49.

[12]張興，趙善歡. 楝科植物對幾種害蟲的拒食和忌避作用[J]. 華南農(nóng)學院學報，1983，4（3）：1-7.李屹，韓睿，王麗慧，等. 菊芋葉片提取物對辣椒疫霉菌的抑菌效果及盆栽驗證試驗[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（1）：139-141.