IL-1β對膿毒癥新生幼鼠胼胝體內少突膠質細胞前體細胞分化成熟的影響*

解 迪， 曾紅科， 陳純波△， 鄧醫宇△

(1南方醫科大學研究生學院， 廣東 廣州 510515； 2廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院急危重癥醫學部，廣東 廣州 510080)

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·論 著·

IL-1β對膿毒癥新生幼鼠胼胝體內少突膠質細胞前體細胞分化成熟的影響*

解 迪1,2， 曾紅科2， 陳純波2△， 鄧醫宇2△

(1南方醫科大學研究生學院， 廣東 廣州 510515；2廣東省人民醫院，廣東省醫學科學院急危重癥醫學部，廣東 廣州 510080)

目的： 探討IL-1β對少突膠質細胞前體細胞(OPCs)分化成熟及軸突髓鞘化的影響。方法: 將出生1 d的SD幼鼠96只隨機分為2組：對照組和脂多糖(LPS)組各48只。LPS組給予腹腔注射1mg/kg LPS，對照組腹腔注射等體積PBS。根據注射后時間分為3 h、24 h、3 d、7 d、14 d、28 d 6個亞組，應用雙標免疫組化及Western blotting的方法觀察3 h、24 h、3 d、7 d時IL-1β及IL-1受體1(IL-1R1)的表達和14 d、28 d時髓鞘堿性蛋白(MBP)的表達。進行原代OPCs培養將其分為對照組、IL-1β組、IL-1β+ IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)組及IL-1Ra組。將其誘導分化3 d后利用免疫熒光及Western blotting比較4組間MBP的表達。結果: 與對照組相比，LPS注射后3 h、24 h、3 d、7 d幼鼠胼胝體小膠質細胞表達IL-1β明顯增加，其受體在OPCs表達增加。LPS注射后14 d、28 d，MBP在胼胝體的表達下降。細胞實驗顯示原代OPCs培養誘導分化3 d后IL-1β可以抑制MBP的表達，并且可以被IL-1Ra逆轉。IL-1β可抑制磷酸化ERK的表達，ERK過表達可逆轉IL-1β對MBP的抑制作用。結論: 在膿毒癥新生幼鼠胼胝體內IL-1β有可能通過抑制ERK通路來抑制OPCs成熟，從而導致腦白質軸突低髓鞘化。

膿毒癥； 胼胝體； 白細胞介素1β

新生兒膿毒癥是臨床常見的疾病[1]，可引起神經系統發育不良，從而導致神經性視聽障礙、認知功能障礙，嚴重時甚至導致癲癇和腦癱[2-3]。膿毒癥相關性腦損傷的一個重要特征是腦室周圍腦白質損傷(periventricular white matter damage,PWMD)，其機制目前尚不明確，感染激發腦白質內炎癥反應可能是其機制之一。PWMD的重要病理改變是少突膠質細胞的分化成熟受到抑制[4-5]。少突膠質細胞是腦內重要的髓鞘形成細胞，成熟的少突膠質細胞可與軸突形成髓鞘，保證神經信號的正確轉導。它是由少突膠質細胞前體細胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)發育而來。由于OPCs的易損性，許多因素可以影響OPCs的發育，從而導致OPCs成熟障礙和軸突低髓鞘化，影響神經信號正確傳導[6]。小膠質細胞是中樞神經系統中主要的早期炎癥細胞，在受到促炎刺激后，可釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)[7]。有研究證實，腹腔內注射IL-1β可以導致少突膠質細胞成熟障礙及低髓鞘化[8]，但IL-1β是否可直接影響和通過何種途徑影響OPCs的成熟尚不清楚。本文通過建立新生鼠膿毒癥相關腦損傷模型，用雙標免疫組化及免疫印跡的方法觀察早期IL-1β及IL-1受體1(IL-1 receptor 1，IL-1R1)的細胞定位及表達，觀察軸突髓鞘化的標志蛋白——髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表達從而證實膿毒癥新生幼鼠發育成熟后出現軸突低髓鞘化。為探討這種現象背后的原因，在體外進行OPCs培養，用免疫熒光及免疫印跡的方法觀察IL-1β處理3 d后OPCs中MBP的表達，從而初步探討IL-1β對OPCs分化成熟及軸突髓鞘化的影響及潛在機制。

材 料 和 方 法

1 材料

取1 d新生幼鼠進行實驗操作，實驗鼠在暨南大學動物實驗中心進行飼養，自然飲食。兔抗IL-1β、鼠抗硫酸軟骨素蛋白多糖抗體(chondroitin sulfate proteoglycan,CSP/NG2)、小鼠抗MBP(Millipore)；磷酸化ERK1/2、總ERK1/2(CST);兔抗IL-1R1(Santa Cruz);凝集素(lectin)購自Sigma。

2 方法

2.1 實驗設計 將新生的96只SD幼鼠隨機分為2組，對照組和來源于大腸埃希菌 O55:B的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)組。LPS組腹腔注射1 mg/kg LPS，對照組注射等體積的PBS，每組在注射后24 h、28 d時各取6只進行灌注固定后行雙標免疫組化染色，在注射后3 h、24 h、3 d、7 d、14 d、28 d時各取6只乳鼠留取胼胝體區后行Western blotting檢測。

2.2 免疫熒光染色 每組動物灌流、固定后移入30%蔗糖溶液過夜。萊卡冰凍切片機-20 ℃低溫取視交叉水平冠狀切片，片厚10 μm。取P24 h腦切片分2組，第1組用胎牛血清封閉后，再用兔抗IL-1β(1∶100)4 ℃孵育過夜后，PBS清洗3次，每次5 min，滴加帶紅色熒光的Ⅱ抗工作液和lectin(小膠質細胞標志物)室溫下孵育1 h。第2組切片用兔抗IL-1R1和鼠抗NG2混合孵育4 ℃過夜，漂洗，滴加驢抗鼠-FITC和驢抗兔-CY3室溫孵育1 h，用抗熒光淬滅封片劑(碧云天)封片。取P28 d的腦切片用鼠抗MBP 4 ℃孵育過夜后，PBS清洗3次，每次5 min，滴加帶紅色熒光的Ⅱ抗工作液，室溫下孵育1 h，PBS清洗3遍后，封片。在熒光顯微鏡(Olympus)下觀察結果。

2.3 Western blotting檢測 取新鮮的胼胝體用裂解液提取蛋白，測蛋白濃度，蛋白定量為50 μg后進行電泳、轉膜、封閉，于4 ℃冰箱孵育兔源IL-1β抗體(1∶1 000)、兔源IL-1R1抗體(1∶200)、鼠源MBP抗體(1∶1 000)過夜。次日取出在TBST漂洗后于4 ℃冰箱孵育抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)或抗兔Ⅱ抗(1∶1 000)1 h，TBST洗膜后在暗室中加入預混好的ECL發光液，壓片，曝光。各蛋白條帶的信號強度用Fluor Chem 8900 灰度分析軟件進行分析。

2.4 體外OPCs培養及誘導分化 取出生1 d的乳鼠，取腦皮質于0.125%胰蛋白酶中消化10 min后加血清中和，接著用移液槍輕柔吹打1～2 min，靜置后取上清在1 200 r/min的條件下離心5 min，棄去上清，用含10%血清的完全培養基重懸細胞，然后種至多聚賴氨酸預包被的75 cm2培養瓶。第2天完全換液，培養至第3～4天，細胞融合度達到70%時，加入少突膠質細胞增殖培養基，之后每3 d換1次液，培養至7～10 d時，可見大量的OPCs，將培養瓶置于恒溫水平搖床上，37 ℃、180 r/min 1 h，以除去小膠質細胞。丟棄細胞懸液，加入增殖培養基，再在恒溫水平搖床上，37 ℃、200 r/min 18～20 h。吸出懸液靜置于未涂多聚賴氨酸的培養瓶內，37 ℃、5% CO2的培養箱中靜置15 min，去除少量胞體較大的星形膠質細胞和成纖維細胞。吸取細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入OPCs分化培養基，重懸細胞，以1×108/m2密度接種于多聚賴氨酸包被的24孔板中用于免疫熒光；以1×1010/m2密度接種于多聚賴氨酸包被的6孔板中用于免疫蛋白印記，待細胞貼壁后進行操作。將細胞分為對照組、IL-1β組(30 μg/L)、IL-1β+IL-1Ra組(30 μg/L)、IL-1Ra組(30 μg/L)，每組的細胞數保持相同，誘導分化3 d。培養3 d后用PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min，按常規免疫熒光細胞化學方法進行MBP染色。在熒光顯微鏡下隨意選取不同的視野拍照，進行細胞計數。提取培養3 d后的蛋白進行電泳、轉膜、封閉，鼠源MBP抗體(1∶1 000)過夜，次日取出在TBST漂洗后于4 ℃冰箱孵育抗小鼠Ⅱ抗(1∶1 000)1 h、洗膜，曝光，各蛋白條帶的信號強度用Fluor Chem 8900 灰度分析軟件進行分析。

2.5 質粒轉染 構建ERK目的基因，加載于pEGFP載體上,進行質粒轉染，使用6孔板，胞數為3×105cells/well, 將4 μg DNA溶于240 μL Opti-mem無血清培養基中(A管)。將10 μL Lipofectamine 2000(Life) 溶于240 μL Opti-mem無血清培養基中，混勻室溫放置5 min(B管)。 將A、B兩管混合，放置20 min(C管)。轉染期間，將6孔板培養基換成無血清培養基，每孔2 mL。將C管混合液加入6孔板對應孔中，4～6 h換成有血清培養基，后續進行Western blotting實驗，步驟同前。

3 統計學處理

所有數據均使用SPSS 13.0統計學分析軟件分析,計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示。 Western blotting數據在多組間比較時采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗方法分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 雙標免疫組化及Western blotting檢測IL-1β和IL-1R1的表達與定位

免疫熒光顯示處理24 h后lectin標記的小膠質細胞(綠色)與炎癥因子IL-1β(紅色)在胼胝體的分布情況，胼胝體內小膠質細胞呈阿米巴樣，此為小膠質細胞的激活態。我們可以看到lectin標記的小膠質細胞可與IL-1β的共定位情況(黃色)，說明IL-1β由小膠質細胞產生，與對照組相比，LPS組IL-1β表達水平明顯升高。Western blotting結果顯示在17 kD處可檢測到IL-1β，且統計數據顯示各時點LPS組的IL-1β表達均升高(P<0.05)，進一步驗證了免疫熒光的結果，表明LPS注射后IL-1β表達確實有增高，見圖1。

Figure 1.The expression of IL-1β in corpus callosum of septic neonatal rats(immunofluorescence staining，×400). Mean±SD. n=6．*P<0.05 vs control.

免疫熒光顯示處理24 h后NG2標記的OPCs細胞(綠色)與IL-1R1(紅色)在胼胝體的分布情況，我們可以看到NG2標記的OPCs細胞與IL-1R1的共定位情況(黃色)，說明OPCs上存在IL-1R1，與對照組相比，LPS組IL-1R1表達升高，Western blotting結果顯示在80 kD處可檢測到IL-1R1，且統計數據顯示各時點LPS組的IL-1R1表達均升高(P<0.05)，進一步驗證了免疫熒光的結果，表明LPS注射后IL-1R1表達確實有增高，見圖2。

Figure 2.The expression of IL-1R1 in corpus callosum of septic neonatal rats(immunofluorescence staining，×400). Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control.

2 免疫組化與Western blotting檢測MBP的表達情況

免疫組化顯示處理28 d后MBP(紅色)在胼胝體的分布，LPS組胼胝體內MBP表達較對照組減弱，說明LPS組胼胝體內軸突髓鞘化明顯減低，Western blotting結果顯示在21 kD處可檢測到MBP的表達，且統計數據顯示14 d及28 d LPS組的MBP表達均下降(P<0.05)，進一步說明LPS處理28 d后軸突髓鞘化減低，見圖3。

3 IL-1β抑制原代OPCs的分化成熟

免疫熒光顯示，誘導分化3 d后，DAPI標記的細胞核呈橢圓形，MBP標記的成熟少突膠質細胞呈中間亮、多突觸樣，我們可以看到MBP陽性的細胞數，與對照組相比，IL-1β組MBP陽性細胞的比例明顯減少，加入IL-1Ra后(IL-1β+IL-1Ra組)MBP陽性細胞比例有所回升，結果提示IL-1β可導致少突膠質細胞分化障礙，且這種作用可以被IL-1Ra所逆轉。Western blotting結果顯示處理3 d后在21 kD處可檢測到MBP的表達，且統計數據顯示IL-1β組MBP表達下降，IL-1β+IL-1Ra組MBP表達較IL-1β組有所回升，IL-1Ra、LPS本身對MBP表達無影響。提示IL-1β可直接導致少突膠質細胞分化成熟障礙而非LPS的直接作用，見圖4。

4 IL-1β在調控分化方面與ERK通道的關系

在各組處理6 h后我們可在42 kD、44 kD處檢測到磷酸化的ERK1/2(phospho-ERK1/2,p-ERK)的表達，統計數據顯示IL-1β組p-ERK表達下降，IL-1β+Ra組ERK表達較IL-1β組有所回升(P<0.05),提示IL-1β可抑制ERK通道的激活，且這種作用可以被IL-1Ra所逆轉，在各組處理3 d后可在21 kD處檢測到MBP的表達，統計數據顯示IL-1β組MBP表達下降，ERK過表達組可逆轉MBP下降(P<0.05)。結果提示IL-1β可能通過抑制ERK通路參與OPCs分化的調控，見圖5。

Figure 3.Distribution of myelin sheath in the corpus callosum of P28 control and LPS rats (immunofluorescence staining，×40). Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control.

Figure 4.Effects of IL-1β on differentiation of OPCs (immunofluorescence staining，×400). Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control； #P<0.05 vs IL-1β.

Figure 5.Relationship between IL-1β and ERK pathway. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs IL-1β.

討 論

LPS介導的膿毒癥可引起全身炎癥反應，導致多器官功能損傷，腦白質損傷是其中之一，腦白質損傷可能由腦內固有免疫或外周因子入腦所致,兩者具有交叉或獨立的作用。中樞神經系統的免疫過程十分復雜，其中包括炎癥細胞浸潤和大量炎癥因子的釋放[9-10]。炎癥因子與其相應的受體相互作用可能介導了后續靶細胞損傷[11]。小膠質細胞是腦內的固有免疫細胞，它受到刺激后可釋放大量的炎癥介質如IL-1β,這可能是腦白質損傷的機制之一，我們的研究結果顯示IL-1β可與活化的小膠質細胞共定位，且7 d以內的LPS組IL-1β表達明顯高于對照組，這些結果提示小膠質細胞是腦內早期的炎癥細胞，可早期被激活并持續釋放大量的炎癥介質如IL-1β，啟動腦內免疫過程，這可能是腦內IL-1β的來源之一。IL-1R分為IL-1R1和IL-1R2,目前認為IL-1β與IL-1R1相互作用可導致靶細胞的功能改變[11]。為了探究OPCs上是否存在IL-1R1，我們進行進一步研究，發現少突膠質細胞前體細胞上存在IL-1R1，且LPS處理后IL-1R1表達明顯升高，以上結果提示大量炎癥因子IL-1β與其表達升高的IL-1R1間相互作用可能會對少突膠質細胞的發育產生影響。

為了研究LPS注射后是否會對OPCs的發育產生影響，我們發現14 d及28 d時LPS注射組MBP表達降低，這個結果提示LPS注射后導致胼胝體內軸突髓鞘化程度降低，MBP是軸突髓鞘化的標志性蛋白，也是OPCs分化成熟的標志蛋白。軸突的髓鞘化是成熟少突膠質細胞突起纏繞軸突形成的多層脂質髓鞘，此過程包括3個方面:(1)OPCs分化成熟;(2)神經元軸突成熟;(3)成熟少突膠質細胞向軸突遷移、黏附并纏繞形成髓鞘[12]。OPCs是腦內重要的髓鞘形成細胞，其分化和成熟在軸突髓鞘化中起著關鍵作用。成熟的少突膠質細胞由OPCs分化而來，其分化過程大致分為Pre-O-2A、O-2A progenitor、pro-oligodendroblast、immature oligodendrocyte和mature oligodendrocyte 5個發育階段[13-14]。LPS、IL-β、IL-1R1與OPCs分化障礙之間是否存在聯系，在動物體內無法探明，為了探明LPS-IL-1β-OPCs分化成熟之間是否存在特異性的聯系，我們進行了體外細胞實驗，探討其可能的機制。體外細胞實驗顯示直接加入IL-1β可導致MBP表達明顯下降，并且這種下降可以被IL-1Ra所逆轉，但IL-1Ra及LPS本身對MBP表達的無影響，提示LPS可能通過IL-1β介導OPCs分化成熟障礙而非其本身。據報道ERK信號通路在少突膠質細胞分化方面起至關重要的作用[15]。因此為了探究IL-1β通過何種途徑影響OPCs的成熟，我們首先檢測了IL-1β對ERK通道的影響，發現IL-1β可以抑制ERK通道的激活，隨后為了明確ERK通道與MBP之間的關系，我們構建了ERK目的基因轉染入細胞，發現IL-1β可降低MBP及ERK的活性，與此同時提高ERK的活性可以遏制IL-1β對MBP的影響，說明IL-1β可能通過抑制ERK的活性來抑制OPCs的分化，這可能是IL-1β影響OPCs分化的機制之一。

綜上所述，我們可以推測膿毒癥新生幼鼠腦胼胝體內的炎癥因子IL-1β可與IL-1R1相互作用從而抑制ERK通道的激活導致OPCs分化成熟障礙，最終導致軸突低髓鞘化，我們驗證了膿毒癥誘導的腦白質損傷的部分病理機制，并提出IL-1β對OPCs的分化成熟具有獨立的作用，這對我們理解炎癥誘導的腦白質損傷機制以及治療具有重要意義。

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Effects of microglia-derived IL-1β on differentiation of OPCs in corpus callosum of septic neonatal rats

XIE Di1,2, ZENG Hong-ke2, CHEN Chun-bo2, DENG Yi-yu2

(1SouthMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofEmergency&CriticalCareMedicine,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail:gghicu@163.com;yiyudeng666@163.com)

AIM: To explore whether IL-1β inhibits the oligodendrocyte precursor cell (OPCs) differentiation and affects axonal myelination. METHODS: One-day-old SD rats were randomly divided into control group and LPS group (48 rats in each group). The rats in LPS group were intraperitoneally injected with 1 mg/kg LPS. The rats in control group were injected with an equal volume of PBS. The rats in each group were further divided into 3 h, 24 h, 3 d, 7 d, 14 d and 28 d subgroups after injection. The expression of IL-1β and IL-1R1in the rat corpus callosum at 3 h, 24 h, 3 d, 7 d was determined by double immunofluorescence and Western blotting. The myelin basic protein(MBP) expression in the rat corpus callosum at 14 d, 28 d after injection was also measured.Invitro, primary OPCs culture was performed and divided into control group, 30 μg/L IL-1β group, 30 μg/L IL-1β+IL-1Ra group and 30 μg/L IL-1Ra group. The expression of MBP in the OPCs induced differentiation for 3 d was observed by double immunofluorescence and Western blotting. RESULTS: The expression of IL-1β and IL-1R1in the rat corpus callosum at 3 h, 24 h, 3 d, 7 d after LPS injection was obviously increased and the expression of MBP in the rat corpus callosum at 14 d, 28 d in LPS group was obviously decreased compared with control groupinvivo. The level of MBP was significantly decreased after IL-1β treatment for 3 dinvitro. However, IL-1Ra (IL-1R inhibitor) reversed the down-regulation of MBP expression. IL-1β inhibited the expression of p-ERK, ERK over-expression reversed the down-regulation of MBP expression compared with IL-1β group. CONCLUSION: IL-1β inhibits the differentiation of OPCs, which may be involved in ERK pathways, thus leading to axonal hypomyelination in the corpus callosum of septic neonatal rats.

Sepsis; Corpus callosum; Interleukin-1β

1000- 4718(2015)03- 0385- 07

2014- 10- 24

2014- 12- 29

國家自然科學基金資助項目(No. 81271329;No.81471237); 2013年廣東省醫學科研基金資助項目(No. A2013002)

△通訊作者 Tel: 020-83827812; 陳純波 E-mail： gghicu@163.com； 鄧醫宇 E-mail： yiyudeng666@163.com

R363.2; R722.13+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.001