TRPC1在TGF-β1誘導支氣管上皮細胞間充質轉化中的作用*

岳喜磊, 成 瑩, 許繼德, 鐘長江, 楊春濤， 汪 鵬

(廣州醫(yī)科大學生理學教研室，廣東 廣州 510182)

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TRPC1在TGF-β1誘導支氣管上皮細胞間充質轉化中的作用*

岳喜磊▲, 成 瑩▲, 許繼德△, 鐘長江, 楊春濤， 汪 鵬

(廣州醫(yī)科大學生理學教研室，廣東 廣州 510182)

目的： 探究經典瞬時受體電位通道1(TRPC1)在轉化生長因子β1(TGF-β1)誘導人支氣管上皮細胞(16HBE)間充質轉化(EMT)中的作用。 方法: 以16HBE細胞株為研究對象，免疫熒光、RT-PCR和Western blotting檢測16HBE細胞EMT過程中TRPC1 mRNA和蛋白的表達；Western blotting檢測TRPC1阻斷劑和siRNA干擾對16HBE細胞EMT的影響。 結果: (1) TGF-β1刺激后細胞形態(tài)明顯改變，E-鈣黏蛋白表達減少 (P<0.01)，而α-SMA蛋白表達增加 (P<0.05)。(2) TRPC1廣泛存在于16HBE細胞，且TGF-β1刺激后TRPC1 mRNA和蛋白的表達增加 (P<0.05)。(3) 與TGF-β1組相比，阻斷劑和TGF-β1共同作用組或siRNA和TGF-β1共同作用組細胞形態(tài)改變受抑制，E-鈣黏蛋白和α-SMA蛋白表達受抑制 (P<0.05)。結論: TGF-β1誘導16HBE 細胞發(fā)生EMT，其機制可能與其上調16HBE細胞TRPC1有關。

轉化生長因子β1； 人支氣管上皮細胞； 瞬時受體電位通道1； 上皮細胞間充質轉化

支氣管哮喘是一種包括氣道上皮細胞等多種細胞及細胞組分參與的氣道慢性炎癥，是嚴重危害人類健康的常見病。氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑是其主要3大病理特征，而氣道重塑是與氣道高反應和哮喘嚴重程度關系最為密切的因素。哮喘氣道重塑時氣道結構發(fā)生諸多改變，其中包括氣道上皮損傷、上皮下纖維化和氣道壁網狀基底膜增厚等[1]。哮喘氣道上皮細胞在發(fā)生局部損傷后誘發(fā)上皮細胞向肌纖維母細胞轉分化，上皮細胞特征性E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達減少，間充質細胞特征性α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達增加，即發(fā)生了上皮細胞間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。氣道上皮細胞在轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的作用下發(fā)生EMT，參與哮喘氣道上皮下纖維化的發(fā)生，進而參與哮喘氣道重塑和氣道高反應性的發(fā)生發(fā)展[2-3]。目前參與哮喘氣道上皮細胞轉分化的關鍵機制尚不清楚。上皮細胞內Ca2+是調節(jié)細胞生長、增殖、分化、凋亡和基因表達的關鍵信號分子，而研究報道Ca2+內流參與多種細胞EMT的發(fā)生發(fā)展[4-6]。經典瞬時受體電位通道(canonical transient receptor potential channel，TRPC)基因家族編碼的蛋白介導胞外Ca2+內流，是構成鈣庫操縱性Ca2+通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)以及受體操縱性Ca2+通道(receptor-operated Ca2+channels，ROCC)的重要分子基礎，在調節(jié)細胞鈣離子濃度中發(fā)揮著重要作用，特別是TRPC1和TRPC6[7-9]。研究報道TGF-β1通過增加TRPC的表達調節(jié)胞外Ca2+的內流[10-11]，但目前尚未明確在TGF-β1誘導的氣道上皮細胞發(fā)生EMT的機制中是否有TRPC1的參與。本實驗研究TRPC1是否參與TGF-β1誘導的人支氣管上皮細胞EMT的發(fā)生，探討氣道上皮細胞轉分化的分子調控機制，為臨床防治哮喘提出新的靶點。

材 料 和 方 法

1 細胞系和主要試劑

人支氣管上皮細胞系16HBE由廣州醫(yī)科大學實驗醫(yī)學研究中心保存和復蘇。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和1640培養(yǎng)基購自Hyclone；rhTGF-β1購自R&D；兔抗人E-鈣黏蛋白單克隆抗體購自Cell signaling；小鼠抗人α-SMA單克隆抗體、牛血清白蛋白、TRPC通道阻斷劑SKF96365和Triton X-100購自Sigma;兔抗人TRPC1多克隆抗體購自Abcam；β-actin單克隆抗體和ECL試劑盒購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；PrimeScriptTMRT master Mix Kit和SYBR? Premix Ex TaqTMPerfect Real Time試劑盒購自TaKaRa。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與形態(tài)學變化的觀察 16HBE細胞用含10% FBS的培養(yǎng)基體外培養(yǎng)。取第3代細胞接種于6孔板，10% FBS 培養(yǎng)24 h后，換1% FBS培養(yǎng)24 h，實驗分2組處理：①對照組；② 10 μg/L TGF-β1組。細胞培養(yǎng)72 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

2.2 間接免疫熒光法檢測E-鈣黏蛋白和α-SMA在16HBE細胞上的表達 將各組細胞用10% FBS培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛溶液固定，室溫下0.3% Triton X-100通透，5% BSA 37 ℃封閉30 min后分別加入稀釋比例為1∶100的兔抗人E-鈣黏蛋白Ⅰ抗以及小鼠抗人α-SMA的I抗100 μL，以PBS為對照，4 ℃孵育過夜。次日，于37 ℃復溫30 min，分別加入稀釋比例為1∶100的FITC標記的山羊抗兔和山羊抗鼠的Ⅱ抗100 μL，37 ℃避光孵育1 h，DAPI溶液室溫孵育5～10 min，熒光顯微鏡下觀察并拍片。

2.3 Western blotting檢測E-鈣黏蛋白及α-SMA蛋白的表達 各組細胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后按RIPA細胞裂解液說明書提取細胞蛋白。用BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，置沸水煮5 min變性蛋白質；選用5% 濃縮膠，12% 分離膠進行電泳，分別用80 V和100 V電壓。然后在200 mA恒流、4 ℃條件下電轉2 h；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；分別孵育1∶1 000的兔抗人E-鈣黏蛋白Ⅰ抗、1∶500小鼠抗人α-SMA的I抗和1∶2 000小鼠β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3次，每次10 min；再室溫分別孵育與其I抗相對應的HRP標記的羊抗兔IgG及HRP標記的羊抗小鼠IgG 1 h；TBST 洗膜3次，每次10 min；加入ECL反應，用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，并用ImageJ軟件對所得到的條帶進行分析。以β-actin為內參照，分析各組E-鈣黏蛋白以及α-SMA 蛋白的相對含量。

2.4 間接免疫熒光、RT-PCR和Western blotting檢測TRPC1 mRNA和蛋白在16HBE細胞上表達 將第3代細胞接種于6孔板，10% FBS 培養(yǎng)24 h后，換1% FBS培養(yǎng)24 h，實驗分組為：(1)1% FBS對照組；(2)10 μg/L TGF-β1+1% FBS培養(yǎng)基組。細胞培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛溶液固定，室溫下0.3% Triton X-100通透細胞，5% BSA 37 ℃封閉30 min后加入稀釋比例為1∶100的兔抗人TRPC1的I抗100 μL，4 ℃孵育過夜。次日，于37 ℃復溫30 min，加入稀釋比例為1∶100的FITC標記的山羊抗兔的Ⅱ抗100 μL，37 ℃避光孵育1 h，DAPI溶液室溫孵育5～10 min，實驗中，用PBS代替I抗作為陰性對照，在熒光顯微鏡下觀察并拍片。

細胞分組培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后提取總RNA，合成cDNA，再進行PCR擴增反應，TRPC1上游和下游的引物序列分別為5’-GATGTTTGGCCAGTCCAGCTC-3’和5’-ATTCCGGGCTTGTGCAAGTAA-3’，以18S為內參照，逆轉錄條件: 37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。然后再按照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ Perfect Real Time試劑盒說明書用熒光定量PCR儀進行PCR擴增反應。反應條件為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循環(huán)40次，熔解曲線分析95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。2-ΔΔCt法計算各組TRPC1的相對表達量。

將上面分組細胞處理24 h、48 h和72 h后提取細胞蛋白，進行蛋白定量、電泳、轉膜和封閉，分別孵育1∶1 000的兔抗人TRPC1的I抗及1∶2 000小鼠β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。再室溫分別孵育與其I抗相對應的HRP標記的羊抗兔IgG及HRP標記的羊抗小鼠IgG 1 h；加入ECL反應，用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，并用ImageJ軟件對所得到的條帶進行分析，以β-actin為內參照，分析各組TRPC1蛋白的相對含量。

2.5 倒置顯微鏡和Western blotting檢測TRPC1阻斷劑和siRNA轉染對EMT的影響 通過Ambion 公司網站，獲取沉默TRPC1基因(GenBank No.NM-00125 1845.1)的靶序列，合成正義和反義RNA鏈，序列分別為5’-CCACCUGUAAGAAGAUAAUTT-3’和5’-AUUAUCUUCUUACAGGUGGTT-3’，提交序列給上海吉瑪公司合成siRNA。第3代細胞接種于6孔板中，10% FBS培養(yǎng)12～18 h，細胞密度30%～50%時，再按照以下分組處理：(1)mock transfection(轉染試劑)對照組；(2)mock transfection +TRPC1 siRNA組；(3)10 μg/L TGF-β1；(4)10 μg/L TGF-β1 + mock transfection +TRPC1 siRNA組；(5)mock transfection + negative siRNA陰性對照組；(6)10 μg/L TGF-β1+ mock transfection + negative siRNA組；(7)GAPDHsiRNA + mock transfection 陽性對照組。按轉染試劑盒說明書操作進行轉染48 h后，提取細胞總RNA，RT-PCR檢測各組細胞中mRNA的表達情況，結果提示轉染組mRNA抑制率達80%左右，合成的siRNA序列有效。接種第3代細胞，實驗分為：(1)對照組；(2)15 μmol/L SKF96365對照組；(3)siRNA-TRPC1 +對照組；(4)10 μg/L TGF-β1組；(5)15 μmol/L SKF96365 + 10 μg/L TGF-β1組；(6)siRNA-TRPC1 + 10 μg/L TGF-β1組, 處理48 h后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，并提取細胞蛋白，Western blotting分析各組E-鈣黏蛋白以及α-SMA蛋白的相對含量。

3 統(tǒng)計學處理

實驗結果均為3次以上獨立重復實驗所得，實驗數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有計量資料間比較在確定方差齊后采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間的多重比較采用LSD法；如果方差不齊則采用Welch法，組間多重比較采用Dunnett’s T3檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 16HBE細胞的形態(tài)學改變

在倒置顯微鏡下觀察到16HBE細胞培養(yǎng)72 h后，形成融合的單層細胞，呈立方形或小鵝卵石形, 胞間連接緊密，具有典型的上皮細胞鋪路石樣特征。TGF-β1 (10 μg/L) 刺激細胞72 h 后，部分細胞肥大，伸長呈梭形，細胞間隙增大，喪失其原有鋪路石樣生長方式，見圖1。

Figure 1.Morphologic changes induced by TGF-β1 for 72 h observed under inverted microscope (×100).

2 E-鈣黏蛋白及α-SMA在16HBE細胞的定位

免疫熒光檢測結果顯示，E-鈣黏蛋白在正常16HBE細胞中高表達， TGF-β1 (10 μg/L) 刺激細胞48 h后，E-鈣黏蛋白表達明顯減弱。正常16HBE細胞微量表達α-SMA，而TGF-β1刺激細胞48 h后，α-SMA表達明顯增加，見圖2。

Figure 2.Immunofluorescence staining for E-cadherin and α-SMA (green) as well as DAPI-stained nucleus (blue) in 16HBE cells treated with TGF-β1 for 48 h (×200).

3 E-鈣黏蛋白及α-SMA蛋白的表達

Western blotting檢測結果顯示，對照組的16HBE細胞表達E-鈣黏蛋白；TGF-β1 (10 μg/L) 刺激細胞48 h和72 h組后，E-鈣黏蛋白表達量明顯減少，與對照組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。對照組的16HBE細胞表達微量α-SMA蛋白，TGF-β1 (10 μg/L) 刺激48 h和72 h后，α-SMA蛋白表達量明顯增加，與對照組比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

Figure 3.The protein expression of E-cadherin in 16HBE cells. The 16HBE cells were treated with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h. The relative expression levels of E-cadherin protein were normalized to β-actin in the same sample. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs control group.

Figure 4.The protein expression of α-SMA in the 16HBE cells. The 16HBE cells were treated with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h. The relative expression levels of α-SMA protein were normalized to β-actin in the same sample. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group.

4 TRPC1在16HBE細胞的表達

RT-PCR檢測結果顯示，對照組的16HBE細胞表達TRPC1 的mRNA，TGF-β1 (10 μg/L) 刺激細胞24 h、48 h和72 h后，TRPC1的 mRNA表達明顯增加，與對照組比較有顯著差異(P<0.05)。用兔抗人TRPC1抗體進行間接免疫熒光檢測，可見TRPC1廣泛存在于16HBE細胞，見圖5。

Figure 5.The mRNA expression of TRPC1 in the 16HBE cells detected by real-time PCR (A) and the protein expression of TRPC1 in the 16HBE cells detected by immunofluorescence cytochemistry (B). Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group.

5 TRPC1蛋白在16HBE細胞的表達

Western blotting檢測結果顯示：對照組的16HBE細胞表達TRPC1蛋白；TGF-β1 (10 μg/L) 刺激24 h、48 h和72 h后，TRPC1蛋白表達量明顯增加，與對照組比較有顯著差異(P<0.05)，見圖6。

Figure 6.The protein expression of TRPC1 in the 16HBE cells. The 16HBE cells were treated with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h. The relative expression levels of TRPC1 protein were normalized to β-actin in the same sample. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group.

6 SKF96365和siRNA干擾對EMT的影響

倒置顯微鏡下觀察顯示，TGF-β1(10 μg/L)與SKF96365(15 μmol/L)共同作用于16HBE 細胞48 h或用siRNA干擾24 h再加入TGF-β1刺激細胞48 h，16HBE細胞的形態(tài)改變均受抑制，見圖7。Western blotting結果顯示：TGF-β1(10 μg/L)與SKF96365(15 μmol/L)共同作用于16HBE 細胞48 h或用siRNA干擾 24 h再用TGF-β1刺激細胞48 h，由TGF-β1誘導的E-鈣黏蛋白表達量減少受抑制，與TGF-β1組比較顯著增加(P<0.05)，見圖8；而細胞的α-SMA蛋白表達量增加受抑制，與TGF-β1組比較顯著減少(P<0.05)，見圖9。

討 論

支氣管哮喘是常見的慢性氣道炎癥，嚴重危害人類的身心健康，而且，近年來哮喘發(fā)病率和死亡率呈逐年增高的趨勢。經實驗研究和臨床觀察分析發(fā)現，氣道重塑與哮喘患者的預后關系密切。因而，研究氣道重塑的機制對于提高哮喘的治療效果具有重要的現實意義。

EMT是指上皮細胞形態(tài)和生物功能向間充質細胞轉分化的現象，其特征主要表現為上皮E-鈣黏蛋白或緊密連接蛋白表達減少或丟失，失去細胞間緊密連接，導致上皮失去極性，獲得浸潤性和游走遷移能力。臨床研究發(fā)現上皮下纖維化的主要原因是壁網狀基底膜下肌纖維母細胞數量增多，而肌纖維母細胞可由氣道上皮細胞轉分化而來。氣道上皮細胞在發(fā)生局部損傷或缺氧或生長因子等作用下，上皮細胞的黏附分子如E-鈣黏蛋白表達減少，間充質細胞特征性α-SMA表達增加，即發(fā)生EMT。上皮細胞向表達α-SMA的肌纖維母細胞轉分化，可作為肌纖維母細胞一個新的來源，參與氣道重塑。這提示氣道上皮可以作為治療哮喘的重要靶點，有效抑制氣道上皮細胞的間質化可能改善哮喘癥狀。

Figure 7.The effects of SKF96365 and TRPC1 silencing on the morphological changes of the 16HBE cells induced by TGF-β1 (×100). A: the 16HBE cells treated without TGF-β1 for 48 h; B: the 16HBE cells treated with TGF-β1 for 48 h; C: the 16HBE cells treated with SKF96365 for 48 h; D: the 16HBE cells treated with TGF-β1 and SKF96365 for 48 h; E: the 16HBE cells treated with TRPC1 siRNA for 48 h; F: the 16HBE cells treated with TRPC1 siRNA for 24 h, then treated with TGF-β1 for 48 h.

Figure 8.The effects of SKF96365 and TRPC1 silencing on the E-cadherin protein expression in the 16HBE cells induced by TGF-β1. The relative expression levels of E-cadherin protein were normalized to β-actin in the same sample. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs TGF-β1 group.

Figure 9.The effects of SKF96365 and TRPC1 silencing on the α-SMA protein expression in the 16HBE cells induced by TGF-β1. The relative expression levels of α-SMA protein were normalized to β-actin in the same sample. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs TGF-β1 group.

TGF-β超家族是一類由2個結構相同或相近的二硫鍵相連形成的二聚體多肽，哺乳動物TGF-β 家族至少包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 共3種亞型，其中TGF-β1所占比例最高，生物活性最強。根據不同的結構和功能，TGF-β 受體分為I 型受體(Tβ RI)和II 型受體(TβRII)兩大類。TGF-β 與Tβ RII結合后使Tβ RI 發(fā)生磷酸化，使TGF-β 發(fā)揮調控EMT 的生物學作用。抑制TβRII可逆轉和抑制EMT的發(fā)生，TβRII缺失和EMT的下調密切相關。此外，抑制TβRI受體也可阻斷TGF-β 誘導的EMT，使用TβRI化學受體阻滯劑和干擾TβRI基因都能阻斷EMT的發(fā)生并促進上皮細胞表型的表達。研究認為，TGF-β 誘導的EMT主要通過Smads 依賴性信號轉導通路發(fā)揮作用。許多研究證明Smads 信號在TGF-β 誘導的EMT中起重要作用。TGF-β 通過胞內絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結構域磷酸化而激活，導致 Smad2 和Smad3 磷酸化，再與 Smad4 結合，形成三聚體復合物進入細胞核，調節(jié)靶基因的表達，進而調控 EMT的發(fā)生[12]。作為一個重要的致纖維化因子，TGF-β1能夠誘導上皮細胞形態(tài)和生物學功能向間質細胞表型轉分化，促進上皮細胞向肌纖維母細胞轉分化，從而參與氣道纖維化而導致病理生理改變。研究發(fā)現哮喘患者肺泡灌洗液及氣道壁內TGF-β1增高，而體外的實驗研究亦表明損傷的氣道上皮細胞分泌TGF-β1增多[13]。他們的研究證實氣道上皮細胞在TGF-β1的作用下發(fā)生EMT，參與哮喘氣道上皮下纖維化的發(fā)生，進而參與哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展[11]。

Ca2+是多種受體激活后信號轉導過程中的關鍵信號分子，參與調節(jié)細胞的功能。Berridge等[14]的研究表明Ca2+內流的改變在EMT的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，而且主要是SOCC的改變引起的Ca2+內流，其確切的激活機制及涉及的通道尚需更多研究確認。越來越多的研究表明TRPCs通道蛋白參與鈣庫操縱性Ca2+內流(store-operated Ca2+entry，SOCE)調節(jié)，引起細胞外Ca2+內流增加，特別是TRPC1通道。Vergara等[15]研究顯示當TRPC1基因沉默或者TRPC1蛋白表達降低，鈣離子內流減少，細胞內自由Ca2+濃度降低。反之，TRPC1蛋白表達增多，鈣離子內流增加，細胞內自由Ca2+濃度升高。因此，研究TRPC1通道與氣道上皮細胞EMT的關系具有十分重要的意義和應用前景。

本課題組用TGF-β1誘導細胞發(fā)生EMT，結果提示16HBE細胞培養(yǎng)72 h，具有典型的上皮細胞鋪路石樣特征。TGF-β1 作用細胞72 h后，細胞伸長呈梭形，喪失其原有鋪路石樣生長方式，而且上皮細胞表型標志物E-鈣黏蛋白表達明顯減弱，肌纖維母細胞的表型標志物α-SMA表達明顯增加。實驗結果與文獻報道一致，即氣道上皮細胞在TGF-β1的作用下發(fā)生EMT。檢測TRPC1在16HBE細胞上的表達，結果提示TRPC1在16HBE細胞上廣泛表達。用RT-PCR和Western blotting檢測了TGF-β1作用后TRPC1 mRNA和蛋白在16HBE細胞上表達變化，結果顯示TGF-β1作用后TRPC1的mRNA和蛋白表達均明顯上升，而且其改變具有時間依賴性，推測TRPC1可能在TGF-β1誘導16HBE細胞發(fā)生EMT中發(fā)揮了重要作用。

為證實這個推論，我們用TGF-β1與SKF96365 共同作用于細胞，結果與TGF-β1組比較，顯著抑制了TGF-β1誘導的16HBE細胞間質化的作用；用siRNA干擾16HBE細胞的TRPC1基因，再用TGF-β1刺激16HBE細胞48 h，結果與TGF-β1組比較，顯著抑制了TGF-β1誘導的16HBE細胞間質化的作用，這證實了TRPC1參與TGF-β1誘導的氣道上皮細胞間質轉化。

本研究表明，TGF-β1上調了TRPC1的表達，TRPC1阻斷劑SKF96365和干擾16HBE細胞的TRPC1基因均抑制TGF-β1誘導的16HBE細胞的EMT，提示TRPC1參與了TGF-β1誘導16HBE細胞EMT過程，且這一過程可能與其影響胞漿內鈣離子濃度有關。當然，若進一步明確TRPC1通道參與TGF-β1誘導16HBE細胞間質化與胞漿內鈣離子濃度這兩者之間的關系，尚需深入研究。

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Effects of TRPC1 on TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition of human bronchial epithelial cells

YUE Xi-lei, CHENG Ying, XU Ji-de, ZHONG Chang-jiang, YANG Chun-tao, WANG Peng

(DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China.E-mail:xujide@163.com)

AIM: To investigate the role of canonical transient receptor potential channel 1 (TRPC1) in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human bronchial epithelial (HBE) cells induced by transforming growth factor-β1 (TGF-β1). METHODS: EMT of 16HBE cells induced by TGF-β1 were identified by microscopy, immunofluorescence and Western blotting. Immunofluorescence, real-time PCR and Western blotting were applied to detect the mRNA and the protein expression of TRPC1 in the 16HBE cells. The influence of SKF96365 (a TRPC1 blocker) and siRNA-mediated silencing ofTRPC1 on the EMT of the 16HBE cells were detected by microscopy and Western blotting. RESULTS: Treatment with TGF-β1 induced significant morphological changes of the 16HBE cells. Exposure to TGF-β1 decreased the expression of E-cadherin protein (P<0.01) and increased the expression of α-SMA protein (P<0.05) in the 16HBE cells. Immunofluorescence observation indicated that TRPC1 expression in the 16HBE cells was positive. The expression of TRPC1 at mRNA and protein levels was significantly increased in the 16HBE cells after stimulation with TGF-β1 (P<0.05). The morphological changes of the 16HBE cells induced by TGF-β1 were inhibited by SKF96365 andTRPC1 silencing compared with TGF-β1 group. The protein expression of E-cadherin and α-SMA induced by TGF-β1 were inhibited by SKF96365 andTRPC1 silencing compared with TGF-β1 group (P<0.05). CONCLUSION: TGF-β1 induces EMT with the mechanism of up-regulating TRPC1 in human bronchial epithelial cells.

Transforming growth factor-β1; Human bronchial epithelial cell; Transient receptor potential channel 1; Epithelial-mesenchymal transition

1000- 4718(2015)03- 0492- 07

2014- 07- 23

2014- 12- 16

廣東省科技計劃(No. 2012145)； 廣州市高校科技項目(No. 10A149)

△通訊作者 Tel: 020-81340199; E-mail: xujide@163.com

▲并列第1作者

R363.2； R562.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.019