經bcl-2基因修飾的骨髓間充質干細胞移植對缺血性心功能不全兔心功能及血管新生的影響

高 青， 李樹仁， 荀麗穎， 苑可心， 謝悅陶， 張倩輝， 郝清卿， 黨 懿， 齊曉勇

(1河北醫科大學研究生學院， 2河北省人民醫院心內一科，河北 石家莊 050051)

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經bcl-2基因修飾的骨髓間充質干細胞移植對缺血性心功能不全兔心功能及血管新生的影響

高 青1， 李樹仁2△， 荀麗穎2， 苑可心2， 謝悅陶2， 張倩輝2， 郝清卿2， 黨 懿2， 齊曉勇2

(1河北醫科大學研究生學院，2河北省人民醫院心內一科，河北 石家莊 050051)

目的： 探討經bcl-2基因修飾的骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植對急性心肌梗死家兔心肌細胞凋亡、血管再生及心功能的影響。方法: 體外分離、培養、純化兔BMSCs，分別轉染腺病毒及重組腺病毒-Bcl-2。結扎兔冠狀動脈前降支制作心肌梗死(MI)模型，2周后于心梗邊緣區分別注射等量的腺病毒-Bcl-2-BMSCs(MI+Bcl-2-BMSCs組)、腺病毒-BMSCs(MI+BMSCs組)及DMEM液(MI組)。細胞移植4周后經超聲測定心功能；熒光顯微鏡觀察BMSCs的存活及分布；TUNEL法檢測心肌細胞凋亡；real-time PCR檢測VEGF mRNA表達；免疫組化染色法檢測CD31表達，計算新生毛細血管密度。以上數據分別與心功能進行相關性分析。結果: 與MI組相比，MI+Bcl-2-BMSCs組和MI+BMSCs組的心功能改善、細胞凋亡率降低、VEGF mRNA表達增多、毛細血管密度增加，其中MI+Bcl-2-BMSCs組的變化更為顯著(P<0.05)。相關性分析顯示左室射血分數與心肌細胞凋亡率呈負相關；與VEGF mRNA的表達量及毛細血管密度呈正相關(P<0.01)。結論: 經bcl-2基因修飾的BMSCs移植可顯著減少缺血性心功能不全兔心肌細胞凋亡、促進血管再生、改善心功能。

骨髓間充質干細胞； 基因治療； 心肌梗死；bcl-2基因

急性心肌梗死是一種嚴重危害人類身體健康的疾病。心肌梗死(myocardial infarction，MI)導致局部心肌組織發生不可逆的生物學變化，如心肌細胞壞死、凋亡，成纖維細胞增生，膠原蛋白過量堆積，心肌間質纖維化等，最終引起心室重構和缺血性心力衰竭的發生[1]。心肌梗死后有效的細胞替代及血運重建對保護心臟功能,改善遠期預后起關鍵作用。近年來有研究發現骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs)可促進缺血心肌的功能恢復及改善左室重構[2]，因此成為細胞移植治療心肌梗死的常用干細胞類型之一。然而移植細胞在缺血缺氧心肌微環境中常發生大量的凋亡，嚴重影響干細胞療效。bcl-2作為一種抗凋亡基因，可從多個水平抑制細胞凋亡的發生。本研究探討采用bcl-2基因修飾的骨髓間充質干細胞移植對急性心肌梗死家兔心肌細胞凋亡、血管再生、心功能的影響。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

本實驗動物選用健康3月齡新西蘭雄兔共30只，體重約2.5～3.0 kg，由河北醫科大學實驗動物中心提供。其中2只作為骨髓間充質干細胞的供體，28只作為移植的受體。

2 主要實驗試劑及儀器

含增強型綠色熒光蛋白(EGFP)報告基因及bcl-2基因的腺病毒載體(Ad-EGFP-Bcl-2)、含EGFP基因的腺病毒載體(Ad-EGFP)(本課題組前期構建留存)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Roche)；小鼠抗兔CD31單抗、山羊抗小鼠IgG II 抗試劑盒(Abcam)；Percoll 細胞分離液(Pharmacia)；低糖型DMEM(HyClone)；DAPI(Sigma)；TRIzol Reagent(Invitrogen)；反轉錄試劑盒(Promega)；熒光定量PCR試劑盒(BBI)；隨機引物(Promega)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；心臟超聲儀(Vivid I)；7300 實時定量 PCR 儀(ABI)；熒光倒置相差顯微鏡(Leica)。

3 方法

3.1 BMSCs的分離、培養、純化 無菌條件下用骨穿針抽取兔股骨及脛骨處骨髓液共4～5 mL，與肝素混勻，1.073 kg/L Percoll 細胞分離液密度梯度離心+貼壁培養法分離、純化BMSCs，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基中，于37 ℃、5% CO2條件下培養。待細胞生長至80%融合時用0.25%的胰酶消化，按1∶2比例傳代培養[3]。于倒置相差顯微鏡下逐日觀察細胞生長情況和形態特征。

3.2 重組腺病毒載體的構建 重組腺病毒Ad-EGFP-Bcl-2、Ad-EGFP均由本課題組前期構建留存[4]，經反轉錄聚合酶鏈式反應檢測目的基因的表達，測序鑒定目的基因片段正確性。病毒擴增后置于-80 ℃保存(病毒滴度為T=2.5×1013PFU/L)。

3.3 重組腺病毒載體轉染BMSCs 取生長狀態良好的第9代BMSCs，消化后以3×108/L的細胞密度接種于培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h后棄細胞培養基，PBS沖洗3次，于培養瓶中加入無血清培養基1 mL，再加入含Ad-EGFP-Bcl-2或Ad-EGFP的病毒液(MOI=500)轉染BMSCs，轉染2 h內每隔15 min搖晃1次。2 h后棄轉染的病毒液，以PBS沖洗后加入含10% 胎牛血清的培養基繼續培養。細胞轉染72 h后經熒光顯微鏡觀察轉染效率，測定最佳轉染復數(MOI)。

3.4 實驗動物分組及造模 將28只健康新西蘭家兔按隨機數字表法隨機分為MI+Bcl-2-BMSCs組(n=9)、MI+BMSCs組(n=10)和MI組(n=9)。采用開胸結扎兔冠狀動脈前降支的方法制作急性心肌梗死后心功能不全模型。將家兔仰臥固定于手術臺上，連接針形電極至皮下1 cm，記錄心電圖檢查結果。常規消毒、鋪巾，3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉(1 mL/kg)。剪開胸部左側皮膚，鈍性分離皮下組織及肌肉至肋骨。沿胸骨左緣切斷第3、4、5肋骨，放置開胸器暴露并打開心包，暴露左冠狀動脈前降支，于第1對角支近端處用絲線結扎前降支(建模成功標準為心尖部及部分左室前壁心肌由紅色變為暗紫色，局部心肌收縮力減弱，心電圖檢查示ST段呈持續弓背向上性抬高[5-6])，最后逐層關胸。

3.5 細胞移植 造模2周后，收集1×107個細胞用DMEM濃縮至1 mL。再次開胸開通結扎的冠狀動脈，選取心肌梗死邊緣區域4個注射點，采用心肌注射的方法各組分別注射細胞懸液Ad-EGFP-Bcl-2-BMSCs(MI+Bcl-2-BMSCs組)和 Ad-EGFP-BMSCs(MI+BMSCs組)及DMEM液(MI組)(每點各注射0.25 mL)。術后3 d每天肌注青霉素8×105U預防感染。

3.6 超聲影像技術檢測心功能 采用Vivid I心臟超聲儀在術前、術后2周及細胞移植后4周由同一專科醫生行超聲心動圖檢測，測量各組左室射血分數(left ventricle ejection fraction，LVEF)及左室短軸縮短率(left ventricle fractional shortening，LVFS)，所有測量值均取3次測量的平均值。

3.7 免疫組化法染色并計算新生毛細血管密度 細胞移植4周后處死動物，剪開心包膜，暴露心臟，迅速取下心臟，冰生理鹽水沖洗，切取梗死邊緣區心肌組織，置于-80 ℃冰箱內保存備用。將留取的心肌組織制成 6 μm厚冰凍切片，熒光顯微鏡觀察移植細胞存活情況。剩余心肌組織，用4%多聚甲醛液固定，常規石蠟包埋后制成厚約5 μm的切片，HE染色后光鏡觀察組織學形態變化。采用卵白素-生物素-過氧化物酶復合物(ABC)法，對血管內皮細胞標記抗體CD31進行染色。石蠟切片脫蠟至水，經熱修復、3% H2O2去離子水孵育和山羊血清封閉后，滴加小鼠抗兔CD31 I 抗(1∶50)4 ℃過夜。室溫下分別滴加山羊抗小鼠IgG II抗及辣根酶標記鏈酶卵白素(S-A/HRP)孵育。DAB顯色，常規復染、脫水、中性樹膠封片。陽性血管內皮細胞的胞質經染色呈棕褐色，根據染色結果于顯微鏡下觀察并計數各組毛細血管數目，每張切片選5個梗死邊緣區心肌組織中血管密度最高處，取平均單個視野(×100)血管數為毛細血管密度。將所得的新生毛細血管密度與LVEF進行相關性分析。

3.8 原位缺口末端標記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測心肌凋亡細胞 按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，并設陰性對照組 (TUNEL 反應液中不加 TdT)。光鏡下可觀察到正常心肌細胞核染成藍色,凋亡心肌細胞核染成棕褐色。凋亡率的計算：隨機選取梗死邊緣區心肌組織中5個非重疊視野(×200)，計數凋亡心肌細胞數和心肌細胞總數，心肌細胞凋亡率(%)=凋亡心肌細胞數/心肌細胞總數×100 % 。將所得的心肌細胞凋亡率與LVEF進行相關性分析。

3.9 Real-time PCR法檢測心肌組織血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) mRNA的表達 取50 mg心梗邊緣區心肌組織進行研磨，提取總RNA，瓊脂糖凝膠檢測其完整性；按反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，反應條件：42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。引物序列: GAPDH的上游引物為5’-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3’，下游引物為5’-CACTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’，擴增產物為 92 bp[5-6]；VEGF的上游引物為5’-GTGGACATCTTCCAGGAGTACC-3’, 下游引物為5’-GATCCGCATGATCTGCATGGTG-3’，擴增產物為153 bp。將獲得的cDNA按照熒光定量PCR試劑盒操作說明書方法擴增目的基因，PCR熱循環參數為96 ℃ 4 min，然后3步反應：94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環。以 GAPDH 為內參照，將目的基因表達的相對定量值用于統計分析。Real-time PCR 采用2-ΔΔCt(ΔCt=目的基因 Ct值-GAPDH Ct值，ΔΔCt=目的基因ΔCt 值-內參照基因ΔCt 值)法統計分析結果[7]。將所得的VEGF mRNA的表達量與LVEF進行相關性分析。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件分析結果。實驗結果中計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，采用完全隨機設計單因素方差分析(one-way ANVOVA)，多個樣本均數間的兩兩比較采用SNK-q檢驗。計數資料應用χ2檢驗，相關變量間采用直線相關分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 BMSCs的形態觀察

骨髓液經Percoll分離液密度梯度離心后，取白色絮狀物層接種于培養瓶，24～48 h后觀察到散在貼壁的紡錘狀BMSCs，7～10 d時BMSCs呈長梭狀，部分呈三角或多角形，細胞間形成突起，胞核居中，細胞排列疏松。18～21 d可見形態規則的單層融合束狀貼壁細胞，排列緊密呈漩渦狀、放射狀。采用胰蛋白酶消化融合的BMSCs，以1∶2比例進行傳代培養，24 h后細胞完全貼壁，3～5 d后即達80%融合。傳至第10代時細胞生長速度減慢。

2 熒光顯微鏡觀察轉染細胞

病毒轉染24～48 h后，于熒光顯微鏡下觀察到帶有EGFP標記的BMSCs，細胞排列整齊，形態均一，呈長梭狀，經預實驗測定MOI值為500時轉染效率最佳。

3 心肌梗死后心功能不全造模的結果

28只新西蘭雄兔接受造模手術，術后共有24只存活，其中MI+Bcl-2-BMSCs組存活8只，死亡1只；MI+BMSCs組存活8只，死亡2只；MI組存活8只，死亡1只。共死亡4只，其中，2只于結扎前降支過程中因誘發室顫死亡，1只造模后因呼吸驟停死亡，1只于2次開胸細胞移植后48 h死亡。

4 心臟超聲影像學的檢查結果

造模前將各組新西蘭雄兔行心臟超聲影像學檢查，各組兔心功能指標均正常，并于造模后2周(即移植前)及細胞移植后4周，再次行超聲檢查。

經統計學處理發現，術前及術后2周各組間LVEF、LVFS均無明顯差異(P>0.05)；BMSCs 移植后4周，MI+Bcl-BMSCs組和MI+BMSCs組的LVEF值及LVFS值與MI組相比均升高, 其中MI+Bcl-2-BMSCs組的LVEF值、LVFS值又明顯高于MI+BMSCs組及MI組；并且細胞移植4周后，MI+Bcl-2-BMSCs組和MI+BMSCs組的LVEF值及LVFS值均較移植前升高，其中以MI+Bcl-2-BMSCs組的LVEF值及LVFS值升高的更為顯著，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The comparison of LVEF and LVFS in different groups 4 weeks after transplantation. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsMI;#P<0.05vsMI+BMSCs.

圖1 移植后4周各組LVEF及LVFS的比較

5 熒光顯微鏡下觀察移植細胞的存活

細胞移植后4周，處死實驗動物，切取梗死邊緣

區心肌組織，制作冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察，MI+Bcl-2-BMSCs組與MI+BMSCs組可見帶有EGFP標記的移植BMSCs，并且MI+Bcl-2-BMSCs組EGFP表達高于MI+BMSCs組, MI組未見到綠色熒光，見圖2。

6 病理學檢查

切取正常及梗死邊緣區心肌組織，經石蠟包埋、切片、HE染色后，于光鏡下觀察，可見正常心肌細胞形態均一、排列整齊。細胞質染色均勻，成淡藍色，胞核大小一致，呈橢圓形或圓形，居胞質中央。梗死區域的心肌細胞排列紊亂，心肌纖維斷裂，細胞間可見炎癥細胞浸潤。各組梗死邊緣區心肌組織與正常心肌組織比較可發現: MI+Bcl-2-BMSCs組病理學改變較輕微，MI+BMSCs組其次，MI組較嚴重。

Figure 2.BMSCs labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP) in infarction marginal zone (×40). EGFP expression is indicated by red arrows.

圖2 梗死邊緣區心肌組織中增強型綠色熒光蛋白標記的BMSCs

7 細胞凋亡及其與心功能的關系

經TUNEL染色后，光鏡下觀察可見3組均存在染色陽性的凋亡細胞(染色質濃縮、邊集呈棕褐色，核膜裂解，可見染色質被分割成顆粒狀即凋亡小體)。陰性對照組細胞核均呈藍色。經統計學分析，MI+Bcl-2-BMSCs組的凋亡率較MI+BMSCs組顯著降低(P<0.05)，而MI+BMSCs組的細胞凋亡率又明顯低于MI組，見圖3、表1。經統計學分析發現，心肌梗死后左室射血分數與心肌細胞的凋亡率呈負相關(P<0.01)。

8 血管新生情況及其與心功能的關系

細胞移植后4周，將各組石蠟切片經過CD31免疫組化染色，于光鏡下觀察，各組梗死邊緣區心肌組織可見染色陽性的棕褐色血管內皮細胞，MI+Bcl-2-BMSCs組毛細血管密度明顯高于MI+BMSCs組(P<0.05)；而 MI+BMSCs組又顯著高于MI組(P<0.05)，見圖4、表1。經統計學分析發現，心肌梗死后左室射血分數與梗死邊緣區新生毛細血管密度呈正相關(P<0.01)。

Figure 3.Apoptosis of myocardial cells in infarction marginal zone measured by TUNEL (×200). The apoptotic cells are indicated by red arrows.

圖3 梗死邊緣區心肌組織TUNEL染色

表1 各組兔心肌梗死邊緣區細胞凋亡率、新生血管密度及VEGF mRNA表達量的比較

Table 1.The levels of cardiocyte apoptosis rate, neovascular density and VEGF mRNA expression in infarction marginal zone (Mean±SD.n=8)

GroupApoptoticrate(%)NeovasculardensityVEGFmRNAexpressionMI63.38±8.526.88±2.030.64±0.19MI+BMSCs44.14±5.99*14.38±2.92*0.99±0.17*MI+Bcl-2-BMSCs30.75±5.65*#24.25±3.46*#1.64±0.29*#

*P<0.05vsMI;#P<0.05vsMI+BMSCs.

Figure 4.CD31 immunohistochemical staining of neovascular in infarction marginal zone (×100). The neovasculars are indicated by red arrows.

圖4 心肌梗死邊緣區新生血管CD31免疫組化染色

9 心肌梗死邊緣區組織VEGF mRNA表達與心功能的關系

通過real-time PCR法測定心肌梗死邊緣區組織中的VEGF表達量，檢測結果表明MI+Bcl-2-BMSCs組VEGF mRNA表達量明顯高于MI+BMSCs組(P<0.05)，而后者又明顯高于MI組(P<0.05)，見圖5、表1。經統計學分析發現，心肌梗死后左室射血分數與梗死邊緣區心肌組織中VEGF的mRNA表達量呈正相關(P<0.01)。

討 論

傳統的藥物治療、冠脈介入治療及外科手術治療雖然廣泛開展，但僅能有限地緩解癥狀而不能從根源上解決心肌細胞缺失的問題，心肌梗死后心衰的發生率及死亡率仍不斷升高[8]。干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能未分化的細胞，因其具有較好細胞修復、替代和再生潛能，迅速成為心血管疾病治療的新方法。干細胞種類繁多，經大量的相關對比研究發現，骨髓源性干細胞因其獨特優勢，受到研究者的重視[9]。

Figure 5.The level of VEGF mRNA in different groups. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsMI;#P<0.05vsMI+BMSCs.

圖5 各組心肌梗死邊緣區VEGF mRNA表達量的比較

干細胞在治療心肌梗死方面獨具優勢，然而移植后的干細胞在缺血、缺氧等惡劣環境下極低的存活率限制了其發展[10]。為此，人們嘗試基因修飾的方法，即在細胞移植前將抗凋亡基因通過轉染或轉導的方式，使基因結構發生改變，進而從根源上解決干細胞的存活、代謝、增生或分化等能力。目前用于干細胞轉染治療缺血性心肌病研究的目的基因種類繁多，其中尤以抗凋亡基因頗受關注。研究表明，將Pim-1、GSK-3b或組織型激肽釋放酶(tissue kallikrein，TK)等抗凋亡基因修飾的細胞移植到體內后均可使細胞凋亡減少，細胞的生存力增強[11-13]。

理想的細胞轉染方法應具備操作簡便、轉染效率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，且同時具有細胞毒性低的優勢。因此，本實驗采用腺病毒轉染干細胞的方法，將目的基因bcl-2成功轉染至BMSCs內，實驗中未見明顯毒副作用的發生，且轉染效率高。

bcl-2是抗凋亡基因家族的一員，是細胞凋亡的關鍵調節分子，線粒體是其調控內在凋亡途徑的靶點,主要作用于線粒體外膜[14]，通過蛋白-蛋白相互作用形成異源或同源多聚體進而調節孔隙形成蛋白來發揮作用[15-16]。Li等[17]應用抗凋亡基因bcl-2修飾BMSCs后，觀察到在體外低氧環境下經修飾后的BMSCs抗凋亡能力增強，同時VEGF分泌增多，移植體內后存活細胞數目顯著增加，且心功能的改善更為顯著。

本實驗以腺病毒為載體，將bcl-2基因轉導入BMSCs，通過增強型綠色熒光蛋白的表達來分別示蹤2組BMSCs(重組EGFP-腺病毒載體可高效感染骨髓間質干細胞[18]，并且不會影響BMSCs的分化及旁分泌機能[19-20])，細胞移植前于熒光顯微鏡下觀察到MI+Bcl-2-BMSCs組及MI+BMSCs組均可見EGFP標記的綠色熒光蛋白在干細胞內表達，說明攜帶bcl-2基因及空載的腺病毒均已成功轉染入細胞內。應用心肌內注射的方法將轉染成功的各組干細胞分別移植入造模成功的心肌內，細胞移植后4周處死動物，留取梗死邊緣區心肌組織，制備組織切片，再次于熒光顯微鏡下觀察，結果發現MI+Bcl-2-BMSCs組及MI+BMSCs組仍可見EGFP標記的綠色熒光蛋白的表達，且前者明顯多于后者，MI組則始終未見綠色熒光出現。說明移植的BMSCs可在梗死邊緣區心肌組織內存活，且MI+Bcl-2-BMSCs組的BMSCs存活數量較MI+BMSCs組明顯增多。經TUNEL法對心肌細胞凋亡進行檢測發現，MI+Bcl-2-BMSCs組較MI+BMSCs組的細胞凋亡數目明顯減少，而后者又明顯低于MI組。說明BMSCs可使心肌梗死邊緣區的部分缺血心肌細胞凋亡減少，而轉染了bcl-2基因的BMSCs該作用更明顯。超聲影像學檢測發現最終各組心功能產生了差異性變化，經統計分析證實，梗死邊緣區心肌組織內細胞的凋亡率與心功能LVEF之間呈明確負相關關系。

此外，本研究還對各組心肌梗死邊緣區的組織切片進行了免疫組織化學CD31染色，發現在該區有大量染色陽性(呈棕褐色)的血管內皮細胞存在，提示該區域存在血管新生，微循環豐富。并且MI+Bcl-2-BMSCs組染色陽性的毛細血管較MI+BMSCs組及MI組明顯增加，同時在細胞移植4周后MI+Bcl-2-BMSCs組VEGF mRNA的表達量較MI+BMSCs組也明顯增加，心功能明顯改善，經統計學分析證實，VEGF mRNA的相對表達量及新生毛細血管數與心功能LVEF之間存在明顯的正相關關系。由此我們推測bcl-2基因修飾BMSCs移植改善心功能的可能機制為bcl-2基因的導入抑制了部分BMSCs的凋亡，使最終移植后BMSCs的存活量增加；而移植到心肌梗死邊緣區局部的BMSCs除了自身定向分化為心肌細胞，增加了功能性心肌細胞的數量外，同時BMSCs還通過某種分泌方式產生VEGF等細胞因子，進而促進梗死邊緣區心肌組織內毛細血管再生，改善局部微循環，最終導致了心功能的改善。同樣，國外學者也有類似的報道，他們發現移植后的BMSCs與內皮細胞間存在聯分泌及旁分泌樣地相互作用[21]，而移植后的BMSCs將通過該方式產生多種促血管生成因子，營造促進血管再生的微環境[22-23]。這可能是心肌梗死后BMSCs促使局部心肌組織血管生成增加及心功能改善的內在機制。然而最終心功能的改善是否僅與分泌機制相關的微循環改善有關，干細胞是否還可分泌其它種類的細胞因子，或者是通過分泌機制以外的其它方式發揮功能，這些問題都有待我們進一步驗證。

終上所述，經Bcl-2基因修飾的BMSCs移植可較單純BMSCs移植更顯著地減少心肌細胞凋亡、促進血管再生、改善心功能。本實驗為臨床心肌梗死的治療提供了新思路，諸多動物實驗所取得的成就也肯定了干細胞巨大的發展潛力，然而基因修飾干細胞應用于臨床前還存在許多問題亟待解決[24]，例如動物實驗所取得進展能否在臨床復制、該療效是否可以長期維持、移植后遠期安全性問題以及干細胞分離方法、基因轉染的載體選擇、細胞移植途徑及數量的進一步標化等。相信隨著該領域研究的不斷深入，基因修飾干細胞移植將被廣泛應用于臨床。

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Transplantation of bcl-2 gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells improves cardiac function and angiogenesis in rabbit ischemic car-diac insufficiency model

GAO Qing1, LI Shu-ren2, XUN Li-ying2, YUAN Ke-xin2, XIE Yue-tao2, ZHANG Qian-hui2, HAO Qing-qing2, DANG Yi2, QI Xiao-yong2

(1GraduateSchoolofHebeiMedicalUniversity,2DepartmentofCardiology,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China.E-mail:lsr64@126.com)

AIM: To investigate the effects of transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) modified bybcl-2 gene on myocardial cell apoptosis, angiogenesis and cardiac function in the rabbit after acute myocardial infarction (MI). METHODS: The rabbit BMSCs were isolated, cultured and purifiedinvitro. The BMSCs were transfected with adenovirus or adenovirus-Bcl-2. The rabbit model of MI was established by ligation of left anterior descending branch. The rabbits were injected with Ad-Bcl-2-BMSCs (MI+Bcl-2-BMSCs group), Ad-BMSCs (MI+BMSCs group) and DMEM (MI group) in infarction marginal zone 2 weeks after ligation. The cardiac function was evaluated by echocardiography.The apoptosis of myocardial cells was measured by TUNEL. The mRNA expression of VEGF was detected by real-time PCR. The expression of CD31 was examined by immunohistochemical staining, and new blood capillaries were counted at 4 weeks after BMSCs transplantation. The correlation of the above values with cardiac function was analyzed. RESULTS: The cardiac function was better, the apoptotic rate was lower, the mRNA expression of VEGF and the capillary density were higher in both MI+Bcl-2-BMSCs group and the MI+BMSCs group than those in MI group, and those in MI+Bcl-2-BMSCs group increased more obviously .The left ventricular ejection fraction (LVEF) had a negative correlation with the myocardial cell apoptosis rate. A positive correlation with the mRNA expression level of VEGF and the capillary density was also observed. CONCLUSION: The transplantation of BMSCs modified bybcl-2 gene significantly reduces the myocardial cell apoptosis, promotes angiogenesis, improves heart function of the rabbits with MI.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Gene therapy; Myocardial infarction;bcl-2 gene

1000- 4718(2015)04- 0640- 07

2014- 11- 13

2015- 01- 07

R363; R541.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.012

△通訊作者 Tel: 0311-85988732； E-mail: lsr64@126.com