數字PCR技術的發展和應用

詹 成（綜述） 燕 麗王 琳金玉麟陳 力時 雨△（審校） 王 群

（1復旦大學附屬中山醫院胸外科 上海 200032；2復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院放療科 上海 200031）

數字PCR技術的發展和應用

詹 成1（綜述） 燕 麗2王 琳1金玉麟1陳 力1時 雨1△（審校） 王 群1

（1復旦大學附屬中山醫院胸外科 上海 200032；2復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院放療科 上海 200031）

數字PCR（digital PCR，dPCR）技術作為一種全新的核酸檢測方法，通過把反應體系均分到大量反應單元中獨立地進行PCR，并根據泊松分布和陽性比例來計算核酸數量。目前dPCR主要分為微滴式和芯片式兩種。與傳統PCR技術相比，dPCR具有高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對定量的優點。因此，dPCR技術在近年來得到了迅速的發展，廣泛地應用于稀有突變檢測、拷貝數變異分析和復雜樣本基因表達檢測等方面。

數字PCR； 微滴式dPCR； 芯片式dPCR； 突變檢測； 拷貝數變異； 基因表達

【Abstraet】 As a new detection technology for the quantification of nucleic acid，the digital PCR （dDCR）divides reaction mixes into a large number of units，carries out PCR independently in each units，and then calculates the number of nucleic acidsaccording to Poisson distribution and positive ratio.At present，dPCR can be divided into two major kinds：droplet dPCR and chip dPCR.dPCR has the advantages of higher sensitivity，higherprecision，highertolerance and absolute quantification when compared with the traditional PCR technology.Therefore，dPCR technology has been rapidly developing in recent years，and widely applied to the detection of rare mutations，copy number variation analysis and gene expression detection in complicated samples.

【Kcy words】 digital PCR； droplet dPCR； chip dPCR； mutation detection； copy number variation； gene expression

自從PCR技術在20世紀80年代被發明以來，這一方法已經成為生命科學研究領域中最基礎和最常規的實驗方法之一。第一代傳統的PCR技術采用瓊脂糖凝膠電泳的方法來對PCR產物進行分析，但這一方法主要適用于定性和半定量研究。在20世紀90年代初出現了第二代的定量PCR（quantitative PCR，qPCR）技術，通過在反應體系中加入熒光染料，檢測反應中發出的熒光信號達到閾值的循環數即循環閾值（cycle threshold，Ct）來計算目的酸序列的含量。qPCR技術因其快速、簡易和經濟的特點，目前仍被各實驗室廣泛地使用。但qPCR技術所謂的“定量”仍然是相對的，依賴于Ct值和標準曲線。qPCR在目的序列含量低、表達量差異十分微小、反應體系中含大量背景序列或抑制物等情況下，靈敏度和精確度都受到很大限制。在這種背景下，第三代PCR——數字PCR（digital PCR，d PCR）應運而生了。

d PCR技術的原理dPCR的原理并不復雜。首先，dPCR把反應體系均勻分配到大量反應單元中，每個反應單元中不包含或包含一個到多個目的核酸序列，目的核酸序列的數量符合泊松分布。然后在每個反應單元中獨立地進行PCR擴增。擴增結束后，檢測每個反應單元的熒光信號，最終根據泊松分布和熒光信號陽性的反應單元占所有反應單元的比例來計算目的核酸序列的拷貝數。在d PCR反應中熒光信號的產生過程基本與qPCR相同。

d PCR技術的發展早在1992年，在qPCR技術成熟之前，Sykes等［1］使用有限稀釋（limiting dilution）、PCR和泊松分布模型的方法，檢測了復雜背景下低豐度的Ig H重鏈突變基因，進行了極其精細的定量研究，靈敏度可達2/160 000。雖然當時并未明確稱這一方法為“數字PCR”，但此研究已經奠定了d PCR的雛形，并且明確了dPCR檢測中一個極其重要的原則，即以“終點信號的有或無”（allor-none end point）作為定量方法，這也是后來這一方法被命名為d PCR的主要原因［2］。1999年，Vogelstein等［3］首次正式提出了dPCR的概念，他們在結腸癌患者糞便中檢測KRAS基因突變時，首先把樣本分配到384孔板中，然后分別用不同熒光檢測突變基因和正常基因，通過計算突變基因和正常基因的比例來得出突變率。

雖然d PCR技術的原理并不復雜，然而早期在第一步的樣品分配的環節上卻遇到了難以突破的困難，在分配的數量和均勻性上都很難達到要求，這一困難極大地限制了dPCR技術的發展。直到近幾年來，隨著油包水乳化微滴、集成微流體通路（integrated fluidic circuit，IFC）、納米制造等技術的出現和快速發展，dPCR技術終于突破了技術瓶頸，成功地實現了商業化。

目前商業化的dPCR技術可以分成兩大類：微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式dPCR （chip d PCR，cd PCR）技術。dd PCR技術以Biorad公司的QX200系統以及Raindance Technologies公司的RainDrop為代表，其原理是把每個樣本的反應液均勻分割成2萬個（QX200）或100個～1 000萬個（RainDrop）乳液包裹的微液滴，在每個微滴內分別進行PCR擴增反應。然后dd PCR通過類似于流式細胞技術的方法逐個對液滴的熒光信號進行檢測，計算含目標熒光的液滴占所有液滴的比例來檢測目的序列的含量。cdPCR技術以Fluidigm公司的Bio Mark HD系統以及Life Techonology公司的QuantStudio 3D系統為代表，在這一技術中，反應液通過微流控等技術被均勻導入芯片上的反應倉或通孔中進行PCR反應，然后通過類似于基因芯片的方法掃描每個反應倉或者通孔的熒光信號，進而計算目的序列的含量。目前，每張芯片上集成有相互獨立的1萬～4萬個（Bio Mark HD）反應倉或者2萬個（QuantStudio 3D）通孔。

dPCR技術的優勢和應用d PCR技術較qPCR技術有著以下的優勢：（1）高靈敏度。dPCR本質上將一個傳統的PCR反應變成了數萬個PCR反應，在這數萬個反應單元中分別獨立檢測目的序列，從而大大提高了檢測的靈敏度。（2）高精確度。dPCR通過計算在數萬個反應單元中陽性反應單元數量和比例，可以精確地檢測出變化很小的目的序列差異。（3）高耐受性。dPCR技術第一步反應體系分配的過程，可以使背景序列和PCR反應抑制物被均勻分配到每個反應單元，而大部分反應單元中并不含有目的序列，低豐度的目的序列被相對富集于某些反應單元中，從而顯著地降低了這些反應單元中背景序列和抑制物對反應的干擾。另外，dPCR在對每個反應單元進行結果判讀時僅判斷陽性/陰性兩種狀態，不依賴于Ct值，受擴增效率的影響大為降低，對背景序列和抑制物的耐受能力也大大提高。（4）絕對定量。PCR直接計算目的序列的拷貝數，無需依賴于Ct值和標準曲線就可以進行精確的絕對定量檢測。

dPCR的以上優點使得dPCR特別適合于以下方面的應用：

稀有突變檢測 在大量野生型基因存在的情況下精準地檢測低含量的突變基因是目前的研究難點之一，競爭性反應嚴重影響突變基因的檢測［4］。而dPCR技術從背景序列中檢測低豐度目的序列的能力和高靈敏度的特點使得這一技術特別適合在復雜背景中檢測稀有突變。

上皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosinekinase inhibitor，TKI）類分子靶向藥物在目前非小細胞肺癌治療中發揮著重要作用，但幾乎所有從EGFR-TKI藥物獲益的肺癌患者最終都會產生耐藥性，EGFR的T790M突變是這一耐藥性產生的重要原因之一。Isobe等［5］采用dPCR檢測了肺癌術后采用EGFR-TKI靶向藥物治療并最終復發的患者所切除的原發灶、復發灶活檢樣本以及血清游離DNA（cell-free DNA，cf DNA）中T790M突變，發現對于復發灶T790M突變陽性和陰性的患者，原發灶T790M的突變頻率分別為0.78％±0.36％和0.07％±0.09％，血清cf DNA中T790M的突變頻率分別為0.018％±0.023％和0.010％±0. 014％。Reid等［6］采用d PCR研究惡性黑素瘤患者循環腫瘤細胞中BRAF基因V600E和V600K突變，結果表明dPCR在靈敏度上高于qPCR 200倍，檢測下限為0.0005％。這些研究結果表明dPCR在檢測稀有突變上的巨大優勢和超高的靈敏度。目前已有大量研究采用dPCR從患者血清、細胞和組織內檢測疾病相關的稀有突變，為診斷和治療提供了重要的參考［7-10］。

拷貝數變異分析 拷貝數變異（copy number variations，CNV）研究需要極高的定量精度以區別不同拷貝數之間的微小差異，而dPCR具有高精確度的特點，通過精確計定量目標基因與參照基因（拷貝數為1的基因，例如CEP17或RNase P），并計算它們的比值，從而得到目標基因的拷貝數，對不同拷貝數的分辨精度遠高于qPCR和測序。

Qin等［11］采用dPCR技術檢測樣本中的CYP2D6和ERBB2基因CNV，結果表明dPCR技術在CNV檢測上有著很高的分辨率，可以有效地區分低達15％的拷貝數差別（例如區分拷貝數為6 和7時）。而Whale等［12］和Weaver等［13］的研究同樣表明了dPCR技術在CNV檢測上的優勢，分別可以有效區分17％和25％的CNV，并且隨著所用的反應室數目的升高其分辨率可以進一步提升。Bharuthram等［14］比較了dPCR和qPCR對CCL4L 1和CCL 4L2基因CNV的檢測結果，發現d PCR的準確性和重復性都很高，而qPCR在基因拷貝數較高時準確性明顯下降。Davis等［15］研究腦編碼DUF1220結構域CON2亞型的序列拷貝數與認知能力的關系時，采用dPCR技術驗證基因芯片的結果，研究顯示d PCR可以較好地區分CON2的編碼序列多達26～33個的拷貝數。

復雜樣本基因表達檢測 d PCR在石蠟包埋樣本、血液、糞便、食品、土壤、淤泥、標本等樣本的腫瘤標志物檢測、病原微生物檢測、轉基因成分鑒定及含量分析和環境生物學、法醫學、動物學等涉及基因表達的研究中得到了廣泛地應用。這些樣本中含有大量PCR反應的抑制物，極大地影響了PCR反應效率。另外，在某些檢測中，難以制備測定標準曲線所需的標準物質。d PCR不受PCR抑制物的影響、不依賴標準曲線的優勢，使其特別適合于這些復雜樣本中基因表達的準確定量檢測。

Dingle等［16］系統比較了dPCR和qPCR對十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate sodium salt，SDS）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）、肝素等常見PCR抑制物的耐受程度，結果表明dPCR對SDS和肝素的耐受程度遠高于qPCR。Witwer等［17］在研究動物進食前后血漿植物來源的miRNA含量變化時，采用dPCR技術來避免qPCR特異性低、重復性差的問題。Morisset等［18］分別采用d PCR和qPCR在玉米種子中檢測MON810轉基因成分，對比發現d PCR的靈敏度、重復性和對抑制物的耐受性均高于qPCR。Moser等［19］把含胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor 1，IGF1）的腺相關病毒載體注射入小鼠骨骼肌，隨后采用d PCR檢測小鼠血中IGF1，發現dPCR有非常高的靈敏度和重復性。目前已有大量針對復雜樣本基因表達的研究采用d PCR進行檢測，研究結果均體現了dPCR在這方面的優勢［20-26］。

結語dPCR是一個擁有巨大潛力的新興技術，具有高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對定量的優點，已經在稀有突變檢測、CNV分析和復雜樣本基因表達檢測等方面有著廣泛的應用。dPCR技術將會進一步發展與完善，應用范圍也會大大擴展。

［1］ Sykes PJ，Neoh SH，Brisco MJ，et al.Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution［J］. Biotechniques，1992，13（3）：444-449.

［2］ 李春勇.數字PCR技術原理及應用［J］.生物技術世界，2014，84（11）：10-13.

［3］ Vogelstein B，Kinzler KW.Digital PCR［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96（16）：9236-9241.

［4］ Roma C，Esposito C，Rachiglio AM，et al.Detection of EGFR mutations by Taq Man mutation detection assayspowered by competitive allele-specific Taq Man PCR technology［J］.Biomed Res Int，2013，2013：385087.

［5］ Isobe K，Hata Y，Tochigi N，et al.Usefulness of nanofluidic digital PCR arrays to quantify T790M mutation in EGFR-mutant lung adenocarcinoma［J］. Cancer Genomics Proteomics，2015，12（1）：31-37.

［6］ Reid AL，Freeman JB，Millward M，et al.Detection of BRAF-V600E and V600K in melanoma circulating tumour cells by droplet digital PCR［J］.Clin Biochem，2015，48 （15）：999-1002.

［7］ Laurent-Puig P，Pekin D，Normand C，et al.Clinical relevance of KRAS-mutated subclones detected with picodroplet digital PCR in advanced colorectal cancer treated with anti-EGFR therapy［J］.Clin Cancer Res，2015，21（5）：1087-1097.

［8］ Wang Z，Chen R，Wang S，et al.Quantification and dynamic monitoring of EGFR T790 M in plasma cell-free DNA by digital PCR for prognosis of EGFR-TKI treatment in advanced NSCLC［J］.PLoS One，2014，9 （11）：e110780.

［9］ Sanmamed MF，Fernandez-Landazuri S，Rodriguez C，et al.Quantitative cell-free circulating BRAFV600E mutation analysis by use of droplet digital PCR in the follow-up of patients with melanoma being treated with BRAF inhibitors［J］.Clin Chem，2015，61（1）：297-304.

［10］ Bacher U，Dicker F，Haferlach C，et al.Quantification of rare NPM1 mutation subtypes by digital PCR［J］.Br J Haematol，2014，167（5）：710-714.

［11］ Qin J，Jones RC，Ramakrishnan R.Studying copy number variations using a nanofluidic platform［J］.Nucleic Acids Res，2008，36（18）：e116.

［12］ Whale AS，Huggett JF，Cowen S，et al.Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation［J］.Nucleic Acids Res，2012，40（11）：e82.

［13］ Weaver S，Dube S，Mir A，et al.Taking qPCR to a higher level：Analysis of CNV reveals the power of high throughput qPCR to enhance quantitative resolution［J］. Methods，2010，50（4）：271-276.

［14］ Bharuthram A，Paximadis M，Picton AC，et al. Comparison of a quantitative Real-Time PCR assay and droplet digital PCR for copy number analysis of the CCL4L genes［J］.Infect Genet Evol，2014，25：28-35.

［15］ Davis JM，Searles VB，Anderson N，et al.DUF1220 copy number is linearly associated with increased cognitive function as measured by total IQ and mathematical aptitude scores［J］.Hum Genet，2015，134（1）：67-75.

［16］ Dingle TC，Sedlak RH，Cook L，et al.Tolerance of droplet-digital PCR vs.real-time quantitative PCR to inhibitory substances［J］.Clin Chem，2013，59（11）：1670-1672.

［17］ Witwer KW，Mcalexander MA，Queen SE，et al.Real-time quantitative PCR and droplet digital PCR for plant miRNAs in mammalianblood provide little evidence for general uptake of dietary miRNAs：limited evidence for general uptake of dietary plant xenomiRs［J］.RNA Biol，2013，10（7）：1080-1086.

［18］ Morisset D，Stebih D，Milavec M，et al.Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR ［J］.PLoS One，2013，8（5）：e62583.

［19］ Moser DA，Braga L，Raso A，et al.Transgene detection by digital droplet PCR［J］.PLoS One，2014，9（11）：e111781.

［20］ Rothrock MJ，Hiett KL，Kiepper BH，et al.Quantification ofzoonotic bacterial pathogens within commercial poultry processing water samples using droplet digital PCR［J］. Adv Microbiol，2013，3（5）：403-411.

［21］ Tadmor AD，Ottesen EA，Leadbetter JR，et al.Probing individual environmental bacteria for viruses by using microfluidic digital PCR［J］.Science，2011，333（6038）：58-62.

［22］ Kiselinova M，Pasternak AO，De Spiegelaere W，et al. Comparison of droplet digital PCR and seminested realtime PCR for quantification of cell-associated HIV-1 RNA ［J］.PLoS One，2014，9（1）：e85999.

［23］ Racki N，Morisset D，Gutierrez-Aguirre I，et al.One-step RT-droplet digital PCR：a breakthrough in the quantification of waterborne RNA viruses［J］.Anal Bioanal Chem，2014，406（3）：661-667.

［24］ Strain MC，Lada SM，Luong T，et al.Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR［J］. PLoS One，2013，8（4）：e55943.

［25］ Racki N，Dreo T，Gutierrez-Aguirre I，et al.Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant，soil and water samples［J］. Plant Methods，2014，10（1）：42.

［26］ Kim TG，Jeong SY，Cho KS.Comparison of droplet digital PCR and quantitative real-time PCR for examining population dynamics of bacteria in soil［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2014，98（13）：6105-6113.

Thc dcvclopmcnt and applieation of digital PCR

ZHAN Cheng1，YAN Li2，WANG Lin1，JIN Yu-lin1，CHEN Li1，SHI Yu1△，WANG Qun1
（1Department of Thoracic Surgery，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai 200032，China；2Department of Radiation Oncology，Eye and ENT Hospital，Fudan University，Shanghai 200031，China）

Q 311

B

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.06.017

2015-02-06；編輯：王蔚）

國家自然科學基金（81401875，81472225）；上海市自然科學基金（14ZR1406000）

△Corresponding author E-mail：shi.yu@zs-hospital.sh.cn

*This work was supportcd by thc National Natural Seicnec Foundation of China（81401875，81472225）and thc Natural Seicnec Foundation of Shanghai，China（14ZR1406000）.