利用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定梔子中6種成分含量

苗琦　羅揚(yáng)婧　方文娟　等

摘要：以梔子中的6種成分為指標(biāo)，建立其他指標(biāo)成分與梔子苷的相對(duì)校正因子 ，計(jì)算各成分的含量，實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)；同時(shí)采用回歸方程法測(cè)定該6種成分含量，并比較2種方法所得計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的差異，以驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性和可行性。結(jié)果表明：12批梔子中6種成分的計(jì)算值與實(shí)測(cè)值間無顯著差異，利用一測(cè)多評(píng)法控制梔子的質(zhì)量是準(zhǔn)確可行的。

關(guān)鍵詞：一測(cè)多評(píng)；校正因子；HPLC；梔子

中圖分類號(hào)： R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0292-03

收稿日期：2014-09-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2011BAI04B01）；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（編號(hào)：20603020110、20603020213）；江西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)研究生創(chuàng)新專項(xiàng)（編號(hào)：JZYC14C09）。

作者簡(jiǎn)介：苗琦（1989—），男，陜西寶雞人，碩士研究生，主要從事中藥資源開發(fā)與應(yīng)用研究。E-mail：miaoqi6213963@126.com。

通信作者：羅光明，博士，教授，主要從事中藥資源開發(fā)與應(yīng)用研究。Tel：（0791）7118982；E-mail：jzlgm11@163.com。中藥多成分定量和多指標(biāo)質(zhì)量控制中存在的對(duì)照品缺乏問題，是目前中藥多指標(biāo)質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)模式的主要瓶頸之一。僅以1種有效成分含量無法客觀反映中藥材的質(zhì)量，在中藥材對(duì)照品緊缺、價(jià)格高昂的背景下，為了能采用多指標(biāo)客觀反映中藥材質(zhì)量，王智民等率先提出了一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)新模式，該法通過測(cè)定中藥材中固有成分含量，按照相對(duì)校正因子推算該藥材中其他成分含量[1]。QAMS采用僅測(cè)定1種價(jià)廉、易得的成分含量，實(shí)現(xiàn)多成分同步測(cè)定的模式，克服了多指標(biāo)質(zhì)量控制面臨的對(duì)照品短缺和高昂檢測(cè)成本問題。雖然目前該方法已被成功應(yīng)用于木通、黃連、人參等 20 種常用中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[2-4]，但是該方法在梔子（Gardeniae）藥材中的應(yīng)用還鮮有報(bào)道。本研究探索了QAMS 技術(shù)在梔子質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用的可行性，旨在為梔子質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新途徑。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：Waters 2695 separations module型高效液相色譜儀（Waters 2996 photodiode array detector 檢測(cè)器、Waters empower 化學(xué)工作站，美國(guó)Waters公司）；Agilent 1200型高效液相色譜系統(tǒng)，Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)；BP224S型電子天平（Sartorius公司）；KQ-300E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

試劑：甲醇（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；乙腈（色譜純，美國(guó)ACS公司）；甲醇（分析純，西隴化工股份有限公司）；水（娃哈哈牌）；對(duì)照品：京尼平苷酸（編號(hào)111828-201102，純度按96.0%計(jì)算）、綠原酸（編號(hào)110753-201314，純度按96.6%計(jì)算）、梔子苷（編號(hào)110749-201316，純度按97.5%計(jì)算）、西紅花苷-Ⅰ（編號(hào)111588-201202，純度按91.1%計(jì)算）、西紅花苷-Ⅱ（編號(hào)111589-201304，純度按92.4%計(jì)算）購于中國(guó)藥品生物制品檢定所，京尼平1-β-D龍膽二糖苷（批號(hào)為ZM0501BA14，純度>98.0%）購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原理在一定線性范圍內(nèi)，成分的量（濃度，C）與檢測(cè)器響應(yīng)（峰面積，A）呈正比[5]。在進(jìn)行多成分（s， a，b，…，i，…）質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，用中藥材中某一有效成分（廉價(jià)、易得）作為內(nèi)參物（s），建立內(nèi)參物與其他成分（a，b，…，i，…）間的相對(duì)校正因子RCF（fsa，fsb，fsc，…）， 計(jì)算公式為：

fsi=fs/fi=（As/Cs）/（Ai/Ci）

式中：As為內(nèi)參物對(duì)照品s的峰面積；Cs為內(nèi)參物對(duì)照品s的濃度；Ai為某待測(cè)成分對(duì)照品i的峰面積；Ci為某待測(cè)成分對(duì)照品i的濃度。

1.2.2色譜條件Durashell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；梯度洗脫：0～18 min（8%～15% A），18～25 min（15%～23% A），25～40 min（23%～35% A），40～50 min（35%～50% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：238、330、440 nm；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.3供試品溶液的制備稱取供試品粉末（過四號(hào)篩）約0.1 g，置具塞錐形瓶中，加入75%甲醇25 mL，稱質(zhì)量，超聲處理40 min（筆者前期分別考察了50%、60%、75%、100%甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取，發(fā)現(xiàn)采用75%甲醇超聲提取40 min條件下提取率高，因此本研究選用75%甲醇超聲提取40 min作為提取條件），冷卻后再稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過。量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過即得。

1.2.4對(duì)照溶液的制備稱取各對(duì)照品適量，分別置于 50 mL 棕色量瓶中，用適量75%甲醇溶液溶解并定容至刻度，分別制成含京尼平苷酸10.176 μg/mL、京尼平1-β-D龍膽二糖苷201.292 μg/mL、綠原酸4.444 μg/mL、梔子苷311610 μg/mL、西紅花苷-Ⅰ 175.276 μg/mL、西紅花苷-Ⅱ 17.371 μg/mL的1#對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2結(jié)果與分析endprint

2.1一測(cè)多評(píng)法的檢測(cè)結(jié)果

2.1.1線性范圍將1#混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別用75%甲醇稀釋2、4、8、16、32、64倍，作為2#～7#混合對(duì)照品溶液，備用。按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣10 μL，以進(jìn)樣量 10 μL 中對(duì)照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，最佳檢測(cè)波長(zhǎng)下的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、綠原酸、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表1可見，各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2相對(duì)校正因子的計(jì)算以梔子苷為內(nèi)參物，分別計(jì)算京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、綠原酸、西紅花

表1對(duì)照品質(zhì)量與峰面積的線性關(guān)系

對(duì)照品名稱標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)

（r）線性范圍

（μg）京尼平苷酸京尼平1-β-

D龍膽二糖苷綠原酸梔子苷西紅花苷-Ⅰ西紅花苷-Ⅱy=1 610 765x-95y=1 144 290x-1 123y=4 025 629x+744y=1 859 824x+117y=7 633 873x+10 739y=8 706 055x-5760.999 90.999 90.999 70.999 90.999 90.999 90.001 59～0.101 760.031 45～2.012 920.000 69～0.044 440.048 68～3.116 100.027 38～1.752 760.002 71～0.173 71

苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的相對(duì)校正因子。由表2可見，除綠原酸/梔子苷的RSD較大以外（原因可能是綠原酸含量較低，峰面積小，檢測(cè)誤差大導(dǎo)致），其他對(duì)照品相對(duì)校正因子的RSD均小于1%。表2各對(duì)照品的相對(duì)校正因子

編號(hào)f京尼平苷酸/梔子苷f京尼平1-β-D龍膽二糖苷/梔子苷f綠原酸/梔子苷f西紅花苷-Ⅰ/梔子苷f西紅花苷-Ⅱ/梔子苷1#1.153 91.624 60.461 10.243 90.213 52#1.163 01.632 20.459 50.241 30.214 43#1.152 71.633 40.435 30.241 70.214 14#1.156 91.625 60.435 80.242 10.215 65#1.167 91.635 60.447 00.244 00.213 76#1.179 41.628 20.442 00.246 70.211 87#1.154 01.636 90.536 00.244 70.210 0平均值1.161 11.630 90.459 50.243 50.213 3RSD0.84%0.30%7.68%0.78%0.86%

2.1.3精密度試驗(yàn)取2#混合對(duì)照品溶液10 μL，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果表明，梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、綠原酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸的RSD分別為0.55%、0.50%、0.41%、048、0.49%、0.54%，表明儀器精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取2#混合對(duì)照品溶液，分別于樣品制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)峰面積。結(jié)果表明，梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅰ、綠原酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸的RSD分別為1.21%、1.33%、097%、1.74%、1.51%、1.82%，表明供試品溶液在1 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)取同一藥材，按上述方法制成供試品溶液5份，測(cè)峰面積。結(jié)果表明，梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ、綠原酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、京尼平苷酸的RSD分別為1.36%、1.89%、0.59%、1.30%、0.77%、143%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6加樣回收率試驗(yàn)稱取已知含量的樣品5份，加入 2 mL 混合對(duì)照品溶液，按照本研究方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定6種有效成分的峰面積，并計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果表明，平均回收率分別為9932%、99.48%、99.19%、99.34%、99.51%、99.65%，表明該方法回收率較好。

2.2校正因子的重現(xiàn)性考察

2.2.1色譜柱及高效液相色譜儀考察取1#～7#混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、綠原酸、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的相對(duì)校正因子。并考察Waters 2695-2996、Agilent 1200、Agilent 1 260 等3種高效液相色譜系統(tǒng)和Promosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Durashell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）等3種色譜柱下的相對(duì)校正因子。由表3中的RSD值可知，不同儀器及不同色譜柱下的相對(duì)校正因子差異并不明顯。表3不同儀器和色譜柱條件下測(cè)得的相對(duì)校正因子

儀器色譜柱相對(duì)校正因子f京尼平苷酸/梔子苷f京尼平1-β-D龍膽二糖苷/梔子苷f綠原酸/梔子苷f西紅花苷-Ⅰ/梔子苷f西紅花苷-Ⅱ/梔子苷Waters2695Durashell C181.161 11.630 90.459 50.243 50.213 3Promosil C181.157 81.612 40.450 30.240 60.216 6Diamonsil C181.160 41.643 70.463 90.246 20.210 9Agilent1200Durashell C181.159 01.628 30.472 70.239 10.215 1Agilent1260Durashell C181.158 41.632 10.441 20.242 20.214 7平均值1.159 31.629 50.457 50.242 30.214 1RSD0.12%0.69%2.66%1.13%1.00%endprint

2.2.2不同試驗(yàn)條件對(duì)比用同一色譜柱Durashell C18（46 mm×250 mm，5 μm），在2個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行一測(cè)多評(píng)方法的試驗(yàn)。結(jié)果表明，除實(shí)驗(yàn)室1中綠原酸/梔子苷差異較大外，其他相對(duì)校正因子差異較小，RSD小于1.5%（表4）。表4不同試驗(yàn)條件下測(cè)得的校正因子

編號(hào)f京尼平苷酸/梔子苷f京尼平1-β-D龍膽二糖苷/梔子苷f綠原酸/梔子苷f西紅花苷-Ⅰ/梔子苷f西紅花苷-Ⅱ/梔子苷實(shí)驗(yàn)室1實(shí)驗(yàn)室2實(shí)驗(yàn)室1實(shí)驗(yàn)室2實(shí)驗(yàn)室1實(shí)驗(yàn)室2實(shí)驗(yàn)室1實(shí)驗(yàn)室2實(shí)驗(yàn)室1實(shí)驗(yàn)室21#1.153 91.143 91.624 61.611 60.461 10.453 10.243 90.252 10.213 50.209 12#1.163 01.149 51.632 21.620 10.459 50.454 50.241 30.251 40.214 40.205 63#1.152 71.146 61.633 41.617 70.435 30.458 10.241 70.258 30.214 10.211 14#1.156 91.147 11.625 61.614 30.435 80.457 00.242 10.257 00.215 60.206 85#1.167 91.143 31.635 61.616 50.447 00.456 30.244 00.257 30.213 70.208 66#1.179 41.145 01.628 21.618 40.442 00.459 20.246 70.250 80.211 80.210 27#1.154 01.143 61.636 91.617 20.536 00.452 70.244 70.254 90.210 00.213 5平均值1.161 11.145 61.630 91.616 50.459 50.455 80.243 50.254 50.213 30.209 2RSD0.84%0.20%0.30%0.17%7.68%0.55%0.78%1.22%0.86%1.27%

2.2.3待測(cè)色譜峰定位對(duì)于其他待測(cè)指標(biāo)成分峰的定位，普遍采用相對(duì)保留時(shí)間的定位方法，本試驗(yàn)利用峰的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行定位。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同液相系統(tǒng)、色譜柱相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于5%（表5），由此可知，通過相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行峰定位是可行的。表5不同儀器、色譜柱下的相對(duì)校正因子

儀器色譜柱相對(duì)校正因子r京尼平苷酸/梔子苷r京尼平1-β-D龍膽二糖苷/梔子苷r綠原酸/梔子苷r西紅花苷-Ⅰ/梔子苷r西紅花苷-Ⅱ/梔子苷Waters2695Durashell C180.378 20.771 60.831 11.609 31.756 8Promosil C180.360 30.803 20.880 91.620 61.798 9Diamonsil C180.374 40.799 70.858 31.647 31.813 1Agilent1200Durashell C180.364 30.755 30.806 91.552 81.706 2Agilent1260Durashell C180.367 40.756 30.845 61.678 21.902 4Mean0.3689 20.777 220.8445 61.621 641.795 4RSD1.98%2.97%3.30%2.88%4.06%

2.3一測(cè)多評(píng)法與回歸方程法測(cè)定結(jié)果的比較

按照供試品溶液處理方法制備了12批梔子藥材樣品，分別吸取各供試品溶液10 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。分別采用回歸方程法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定梔子藥材中京尼平苷酸、京尼平1-β-D龍膽二糖苷、綠原酸、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ含量，結(jié)果見表 6。對(duì)2種方法所測(cè)含量值進(jìn)行了t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，2種方法所得梔子藥材含量不存在顯著差異（P>0. 05），且2種方法所得的含量值偏差都在3%以內(nèi)，說明一測(cè)多評(píng)法用于梔子藥材的多成分質(zhì)量評(píng)價(jià)是可行的。表6一測(cè)多評(píng)法和回歸方程法測(cè)得梔子藥材中各組分含量比較

樣品

編號(hào)組分含量（μg/g）京尼平苷酸京尼平1-β-D龍膽二糖苷綠原酸西紅花苷-Ⅰ西紅花苷-Ⅱ回歸方程法QAMS回歸方程法QAMS回歸方程法QAMS回歸方程法QAMS回歸方程法QAMS13 408.83 424.06 467.86 428.0715.1695.88 513.58 596.2964.3958.622 608.82 619.56 676.46 637.3805.1781.97 700.57 783.6829.0823.53245.5243.13 596.53 547.0140.5145.610 306.510 387.81 109.11 103.14225.4222.94 739.64 693.9141.4146.510 410.510 491.81 647.11 640.35211.0208.54 903.44 858.198.4105.39 910.49 991.91 614.01 607.26375.3373.76 164.06 123.1107.8114.311 041.311 122.31 610.31 603.67279.4277.38 351.68 318.31 020.1987.911 916.911 997.8904.8899.28395.5393.98 766.08 733.5150.9155.57 661.87 744.61 652.91 646.19660.8660.77 299.77 261.7150.4155.05 670.35 754.01 143.51 137.410262.9260.74 386.04 339.1103.3110.07 788.57 871.4913.3907.611300.6298.63 966.73 918.5492.9483.010 502.310 583.81 314.71 308.412232.3229.94 400.34 353.535.945.48 309.28 392.0917.9912.3endprint

3討論

梔子具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒等功效。梔子果實(shí)的化學(xué)成分主要包括環(huán)烯醚萜苷類、二萜類（西紅花苷類）、有機(jī)酸酯類及其他類化學(xué)成分[6]。其中梔子苷具有抗炎、解熱、利膽、輕瀉作用；京尼平苷酸具有抗腫瘤和抗氧化作

用；有文獻(xiàn)報(bào)道，京尼平1-β-D龍膽二糖苷能改善戊巴比妥鈉引起的心力衰竭；綠原酸為梔子中主要有機(jī)酸酯類成分，具有顯著的抗癌作用及保肝利膽作用；西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ是西紅花、梔子中共有的色素類成分，具有去黃疸、利膽及明顯的降血脂作用[7]。本研究通過一測(cè)多評(píng)的分析方法對(duì)梔子藥材中6種成分進(jìn)行測(cè)定，為梔子藥材中活性成分的多成分、多指標(biāo)質(zhì)量控制提供了新模式。

環(huán)烯醚萜類化合物是已知梔子藥材中的有效成分，238 nm 為京尼平苷酸、梔子苷、京尼平1-β-D龍膽二糖苷的最大吸收波長(zhǎng)，330 nm為酚酸類物質(zhì)綠原酸常用檢測(cè)波長(zhǎng)，440 nm為西紅花苷類化合物西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ最佳檢測(cè)波長(zhǎng)，因此選用238、330、440 nm為檢測(cè)上述6種成分的波長(zhǎng)。

通過比較一測(cè)多評(píng)法和傳統(tǒng)回歸方程法所得梔子6種成分含量值，發(fā)現(xiàn)兩者之間并沒有顯著差異，且不同實(shí)驗(yàn)室、儀器、色譜柱下各有效成分間的校正因子重現(xiàn)性良好，說明在對(duì)照品不足的情況下，將一測(cè)多評(píng)用于梔子中藥材多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)與質(zhì)量控制是可行的，該方法具有一定的發(fā)展前景。

參考文獻(xiàn)：

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