TGF-β1促進人舌鱗狀細胞癌侵襲遷移的研究

符良斌，廖天安，陳井鑫，胡廣偉

(海南省人民醫院口腔頜面外科，海南 海口 570311)

TGF-β1促進人舌鱗狀細胞癌侵襲遷移的研究

符良斌，廖天安，陳井鑫，胡廣偉

(海南省人民醫院口腔頜面外科，海南 海口 570311)

目的 研究轉化生長因子β1(TGF-β1)能否促進人舌鱗狀細胞癌的侵襲轉移。方法細胞增殖與活性實驗試劑盒(CCK8)檢測比較不同濃度TGF-β1刺激或不刺激舌鱗狀細胞癌細胞株SCC9、CAL27之間生長速度的差異；劃痕實驗檢測比較TGF-β1刺激或不刺激舌鱗狀細胞癌SCC9、CAL27之間的遷移差異；Transwell實驗進一步比較TGF-β1刺激或不刺激舌鱗狀細胞癌SCC9、CAL27侵襲遷移能力的差異。結果CCK8實驗表明低濃度TGF-β1刺激后SCC9、CAL27細胞與空白對照組相比活細胞數量降低，但高濃度組未明顯影響舌鱗癌細胞增殖，差異具有統計學意義(P＜0.05)。劃痕實驗和Transwell實驗均顯示，TGF-β1刺激后SCC9、CAL27細胞與空白對照組相比較具有更強的侵襲能力，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。結論低濃度TGF-β1可以抑制舌鱗癌細胞的增殖，但可以顯著促進舌鱗狀細胞癌侵襲轉移。

轉化生長因子β1；舌鱗狀細胞癌；侵襲遷移

舌鱗狀細胞癌是最常見的口腔癌，具有極強的侵襲性和轉移能力，特別是頸部轉移，嚴重影響患者的生存質量和生存時間[1-2]。舌鱗癌主要是由鱗狀上皮異常增殖形成癌變，經歷從正常黏膜到白斑、原位癌、再到浸潤癌的多階段過程[3]。然而，腫瘤的侵襲轉移是由多種因子相互作用引起的。轉化生長因子β1(Transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是一種具有多種生物學活性的細胞因子，能影響細胞的增殖、分化、凋亡和胞外基質產物進而調控組織的形成和分化[4]。在肺癌、肝癌等研究中已經發現，TGF-β1及其信號通路在腫瘤的發生發展過程中的作用具有雙重性：在腫瘤最初發生階段，上皮細胞對TGF-β1具有高度敏感性，TGF-β1可以抑制細胞增殖分化、誘導細胞凋亡,進而抑制腫瘤的發生發展；但在進展期，上皮細胞內TGF-β1信號通路的某些蛋白發生改變，細胞對TGF-β1的抑制作用產生耐受，反而增強腫瘤的侵襲轉移能力[5-7]。然而，TGF-β1對人舌鱗狀細胞癌作用的相關研究較少，本研究就重點研究TGF-β1對人舌癌細胞株SCC9和CAL27的生長、侵襲遷移能力方面的影響，為進一步探討TGF-β1對人舌鱗狀細胞癌調控的機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養及主要試劑 舌鱗癌細胞株SCC9、CAL27購自美國菌種保藏中心(ATCC)，SCC9在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培養基中培養，CAL27在含10%FBS的高糖DMEM培養基中培養。TGF-β1購自R&D Systems公司，CCK8試劑盒購自同仁化學研究所(DOJINDO)，Matrigel膠購自BD生物技術有限公司，FBS、DMEM-F12培養基和高糖DMEM培養基均購自Gibco公司，Transwell小室、培養板和培養皿購自康寧公司(Corning)。

1.2 CCK8細胞活性實驗 將人舌鱗癌細胞接種于96孔板，約5×103個/孔，實驗組分別加入1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml不同濃度的TGF-β1，置培養箱內培養，1～5 d每天按分組去除96孔板每孔中培養液，每孔加入100 μl以新鮮無血清培養基稀釋5倍的CCK8培養液，繼續培養2 h后終止培養，在酶聯免疫檢測以610 nm處測量各孔的吸光值。

1.3 劃痕實驗 將舌鱗癌細胞種入6孔板，生長至95%左右時，用10 μl的微量加樣槍頭劃出無細胞區，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗去劃痕后脫落的細胞，拍攝劃痕區0 h的圖像，空白對照組以無血清培養基培養，處理組以含5 ng/ml TGF-β1無血清培養基培養，在不同時間點拍照，直至劃痕區已填滿，再次拍照觀察細胞的遷移能力。

1.4 侵襲遷移實驗 將舌鱗癌細胞胰酶消化處理后細胞計數，每個Transwell小室上室等量接種約1×105個細胞/200 μl無血清培養基，空白對照組下室加無血清培養基500 μl，處理組下室加含5 ng/ml TGF-β1培養基500 μl，37℃恒溫箱培養10 h/SCC9、 24 h/CAL27后，取出小室于4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結晶紫染色15 min，擦去小室底膜上層細胞，顯微鏡下計數透過膜的細胞數，隨機取5個100倍視野細胞計數并取其均值。進行侵襲實驗時，首先將50 μl Matrigel加入Transwell小室上室，37℃孵育30 min，然后接種細胞進行下一步實驗，培養時間為20 h/SCC9、48 h/CAL27，其余同前遷移實驗。

2 結果

2.1 低濃度TGF-β1抑制舌鱗癌細胞增殖 CCK8細胞活性試驗顯示，1～5 d后TGF-β1實驗組與PBS對照組比較，1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml濃度TGF-β1組的SCC9在刺激96 h、120 h后活細胞數量明顯減少[t(1ng/ml，96h)=4.512，t(1ng/ml，120h)=6.452，t(5ng/ml，96h)= 4.092，t(5ng/ml，120h)=5.636，t(5ng/ml，96h)=4.838，t(5ng/ml，120h)= 5.025，P＜0.01]，而20 ng/ml、30 ng/ml濃度TGF-β1組的SCC9活細胞數量并無明顯變化[t(20ng/ml，96h)=0.942，t(20ng/ml，120h)=2.125，t(30ng/ml，96h)=2.392，t(30ng/ml，120h)=3.543，P＞0.05]；同樣，1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml濃度TGF-β1組的CAL27在刺激120 h后活細胞的數量明顯減少[t(1ng/ml，120h)=5.126，t(5ng/ml，120h)=6.036，t(5ng/ml，120h)=4.954，P＜0.01]，但20 ng/ml、30 ng/ml濃度TGF-β1組活細胞數量差異無統計學意義[t(20ng/ml，120h)=1.925，t(30ng/ml，120h)= 2.244，P＞0.05]，見圖1，說明較低濃度的TGF-β1抑制舌鱗癌細胞的生長，較高濃度的TGF-β1并無明顯影響舌鱗癌細胞的增殖能力。

2.2 TGF-β1處理的舌鱗癌細胞侵襲遷移能力增強 劃痕實驗顯示，24 h后TGF-β1處理組的舌鱗癌細胞SCC9、CAL27均可把劃過的痕全部覆蓋，而PBS對照組則有明顯的劃痕，說明TGF-β1處理后舌鱗癌細胞的遷移能力顯著提高(見圖2)。Transwell實驗表明，與PBS對照組的SCC9相比，TGF-β1處理的實驗組SCC9細胞直接穿過Transwell小室的數量增加了5.6倍(t=5.042，P＜0.01)，而降解掉基底膜穿過Transwell小室的數量增加了6.8倍(t=6.224，P＜0.01)，見圖3；經TGF-β1處理的CAL27細胞直接穿過Transwell小室的數量增加了5.8倍(t=5.804，P＜0.01)，而降解掉基底膜穿過Transwell小室的數量增加了5.2倍(t=4.684，P＜0.01)，見圖3，進一步說明TGF-β1處理舌鱗癌細胞后侵襲、遷移能力顯著增強。

圖1 CCK8檢測不同濃度TGF-β1刺激的舌鱗癌細胞SCC9、CAL27比較空白對照組細胞在不同時間點的OD比值(aP＜0.05)

圖2 劃痕實驗檢測TGF-β1刺激的舌鱗癌細胞SCC9、CAL27的遷移能力

圖3 Transwell檢測TGF-β1刺激的舌鱗癌細胞SCC9、CAL27的遷移及侵襲能力(×100)

3 討論

腫瘤的侵襲轉移是由多種因子相互作用后發生的。已有文獻在乳腺癌、肝癌等多種實體腫瘤中證實，TGF-β1能通過β-整合素信號傳導途徑等多條信號通路對腫瘤發展轉歸發揮重要作用[8-9]。作為口腔癌中最常見的類型，舌鱗癌的預后與TGF-β1的關系也非常密切。研究表明，TGF-β1和基質金屬蛋白酶-2(MMP2)在口腔鱗狀細胞癌的免疫組化染色中陽性表達率明顯高于正常組織，同時淋巴結轉移者明顯高于無轉移者，說明TGF-β1與腫瘤浸潤轉移密切相關[10]。同時，蛋白印跡和實時定量PCR檢測TGF-β1刺激或者不刺激Tca8113細胞后MTA1和E-cadherin的表達發現，TGF-β1上調MTA1的蛋白和mRNA表達，下調E-cadherin表達水平，也促進Tca8113細胞的侵襲能力，說明TGF-β1信號可以通過MTA1下調E-cadherin表達并促進舌癌的侵襲轉移[11]。進一步成功構建穩定過表達轉化生長因子受體1(TβR1)的UM-SCC-23細胞系后發現，MMP2表達增高的同時細胞侵襲能力增強，說明TGF-β/TβR1通路能夠上調MMP2表達促進頭頸鱗狀細胞癌侵襲[12]。結合我們前面的劃痕實驗、Transwell實驗發現，TGF-β1處理后舌鱗癌細胞SCC9、CAL27較空白對照組能更快的覆蓋劃過的痕、穿過Transwell小室。綜上說明，TGF-β1處理后舌鱗癌細胞侵襲、遷移能力顯著增強，TGF-β1能夠促進舌鱗癌的侵襲轉移。

然而增殖實驗卻表明，較低濃度TGF-β1(1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml)對舌鱗癌細胞SCC9、CAL27的生長增殖具有抑制作用，而較高濃度TGF-β1(20 ng/ml、30 ng/ml)并未明顯影響SCC9、CAL27的增殖能力，這也進一步解釋了在錯綜復雜的腫瘤微環境中細胞因子TGF-β1及其信號通路在腫瘤發生發展中的雙重性，一方面低劑量TGF-β1可以抑制舌鱗癌的生長增殖，然而另一方面卻對舌鱗癌的侵襲遷移具有顯著的促進作用，說明TGF-β1的作用機制更多表現在促腫瘤的侵襲轉移方面，這為以后的科學研究提供重要基礎。同時也有研究發現，TGF-β1能夠成功誘導CAL27以及順鉑耐藥細胞株CAL27-res發生上皮間質轉化，在明顯增強細胞對順鉑耐藥性的同時也抑制細胞增殖，促進腫瘤細胞的凋亡[13]。這進一步說明TGF-β1雖然抑制腫瘤增殖但卻促進腫瘤的侵襲遷移，為我們進一步探討TGF-β1促進舌鱗癌侵襲轉移的機制提供新的思路。

總之，TGF-β1在舌鱗癌的發生發展和侵襲遷移過程中起著重要作用，可能成為新的抗腫瘤浸潤轉移的治療靶點。然而，TGF-β1在促腫瘤侵襲遷移和可能發生上皮間質轉換等過程的具體途徑和機制需進一步實驗驗證，這也為我們下一步的研究提供新的思考。

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Study on TGF-β1in promoting the invasion and metastasis of human tongue squamous cell carcinoma.

FU Liang-bin, LIAO Tian-an,CHEN Jing-xin,HU Guang-wei.
Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Hainan General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo examine the effects of TGF-β1on invasion and metastasis in human tongue squamous cell carcinoma.MethodsCCK8 was used to detect the growth difference of human tongue squamous cell carcinoma lines SCC9 and CAL27,treated with and without different concentration of TGF-β1.Scratch healing and Transwell assay were used to detect the metastasis and invasion difference of SCC9 and CAL27 in presence and absence of TGF-β1.ResultsCCK8 showed that SCC9 and CAL27 treated with lower concentration of TGF-β1had significant reduction than untreated cells,but had no significant difference in higher concentration.Both scratch healing and Transwell assay of SCC9 and CAL27 revealed that TGF-β1-treated SCC9 and CAL27 had greater migration ability than control cells.ConclusionTGF-β1in lower concentration can suppress the proliferation of human tongue squamous cell carcinoma,but also can induce significant invasion and metastasis in human tongue squamous cell carcinoma.

TGF-β1;Tongue squamous cell carcinoma;Invasion and metastasis

R739.86

A

1003—6350（2015）15—2189—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0792

2015-02-05)

符良斌。E-mail：drflb@sina.com