鼻息肉患者外周血Th17細胞的表達及意義

王 悅，馬永明，濮曉萍

(江蘇大學附屬人民醫院耳鼻咽喉科，江蘇 鎮江 212002)

鼻息肉患者外周血Th17細胞的表達及意義

王 悅，馬永明，濮曉萍

(江蘇大學附屬人民醫院耳鼻咽喉科，江蘇 鎮江 212002)

目的 檢測鼻息肉患者外周血中Th17細胞的表達水平，初步探討其與鼻息肉形成的關系。方法收集46例慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者的外周血作為鼻息肉組，另收22例單純鼻出血或者鼻中隔偏曲患者外周血作為對照組。采用流式細胞術檢測兩組患者的外周血中的Th17細胞的表達水平。結果鼻息肉組外周血中Th17細胞的表達水平為(4.03±0.69)%，明顯高于對照組的(1.35±0.26)%，差異有顯著統計學意義(P＜0.05)。結論鼻息肉的發生發展可能與高水平表達Th17細胞存在一定關系，具體發病機制有待進一步研究。

鼻息肉；Th17細胞；發病機制

鼻息肉(Nasal polyps，NP)是一種各種原因導致的鼻腔和鼻竇黏膜慢性炎癥性疾病，成人發病率達1%～4.5%[1]。臨床以持續性鼻塞伴頭痛為主要就診原因，目前治療以類固醇激素噴鼻及鼻內鏡手術為主，該病術后復發率較高，發病機制不明確，近年來，各類炎性細胞及其釋放的炎癥介質與細胞因子成為很多疾病研究的熱點。本實驗小組此前應用免疫組織化學方法對鼻息肉局部組織中IL-17進行了檢測[2]，發現局部鼻息肉組織中IL-17高水平浸潤，推測到鼻息肉患者外周血中以分泌IL-17為主的Th17細胞可能高水平表達。

本研究采用流式細胞術檢測鼻息肉患者外周血中Th17細胞的表達情況，進一步探討它對鼻息肉發生發展的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有組織標本來自2013年10月至2014年5月在本科住院患者。選取慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者46例(鼻息肉組)，其中男性28例，女性18例；以單純鼻出血或鼻中隔偏曲患者22例作為對照組，其中男性14例，女性8例。所有患者取外周靜脈血2 ml，收于乙二胺四乙酸二鉀真空采血管，隨后3 h內提取單個核細胞。所有患者術前1個月內未使用皮質類固醇激素(包括全身和局部)、非類固醇抗炎藥物、組胺藥物或者大環內酯類抗生素治療。患者均無全身疾病、變應性鼻炎、支氣管哮喘或者阿司匹林過敏史。鼻息肉組患者術后病理回報均為鼻息肉；對照組患者均排除鼻-鼻竇炎病史，鼻竇CT檢查無鼻竇病變。本研究經過醫院倫理委員會審查通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑 人淋巴細胞分離液(FICOLL)選自天津TBD生物技術發展中心。單抗隆抗體(包括PE-抗人IL-17A，PE-Cyanine5-抗人CD3，FITC-抗人CD8)及相應同型抗體、Th17細胞破膜液及洗滌液均購于美國eBioscience公司。刺激霉素PMA，離子霉素(Ionomycin)，莫能霉素(Monensin)購自Enzo公司。標準胎牛血清和RPMI-1640液選自維森特生物技術有限公司。0.01 mol/L無菌磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.2)自配后高壓處理。流式細胞儀FACS Canto及FACS Diva軟件為美國BD公司。

1.3 方法 第一步：提取單個核細胞：將外周血2 000 r/min，4℃，離心5 min，去上層血清。用等體積無菌PBS稀釋剩余血細胞，將稀釋的血細胞緩緩加到等體積的ficoll液面之上，2 000 r/min，24℃，離心15 min。取中間白膜層(單個核細胞層)，用1 ml無菌PBS洗滌2遍，500 g/min，4℃，離心5 min，去上清。用1 ml 10%胎牛血清1640稀釋單個核細胞。取其中10 μl，用PBS再稀釋5倍，顯微鏡下鮑氏計數板細胞計數。第二步：流式細胞術：24孔平底細胞培養板每孔約2×106個單個核細胞，，每孔分別加入5 μl PMA(10 ng/μl)，1 μl離子霉素(1 μg/μl)，4 μl莫能霉素(0.5 μg/μl)，加10%胎牛血清1640使總體積為1 ml，置于37℃，5%CO2孵箱刺激5 h。然后收集細胞于無菌1.5 ml EP管，1 ml PBS洗兩遍，500 g/min，4℃，離心5 min。留100 μl PBS重懸，加PE-Cyanine5-抗人CD32 μl，FITC-抗人CD84 μl，置混勻器，4℃冰箱，避光孵育30 min。后離心去上清，1 ml PBS洗滌兩遍，500 g/min，4℃，離心5 min。每管加500 μl破膜液破膜，置混勻器上，4℃冰箱，避光30 min。離心去上清，1 ml洗滌液(原液用雙蒸水按1:9比例稀釋)洗兩遍，500 g/min，4℃，離心5 min。留40 μl洗滌液，加PE-抗人IL-17A 2 μl，置混勻器，4℃冰箱，避光孵育1 h。1 ml洗滌液洗兩遍，500 g/min，4℃，離心5 min，去上清。250 μl PBS重懸，50 μl多聚甲醛固定。所有標本均做同型對照。用FACS Canto檢測Th17細胞的表達水平，并用FACS Diva軟件分析數據。由于既往研究證實PMA刺激會使T細胞胞膜CD4分子表達下降而影響檢測[3]，因此本實驗以 CD3+CD8-IL-17A+代表CD3+CD4+IL-17A+，統計其在CD3+CD8-T細胞中的比率。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計分析軟件對檢測結果進行處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩獨立樣本之間比較應用t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

鼻息肉組與對照組患者外周血中Th17細胞表達水平見圖1。對兩組數據進行t檢驗發現，鼻息肉組患者外周血中Th17細胞的比率較高，達4.73%，見圖1a，而對照組患者外周血中Th17細胞的比率較低，僅1.17%，見圖1b。鼻息肉組患者外周血Th17細胞的比率達(4.03±0.69)%，明顯高于對照組的(1.35±0.26)%，見圖1c。且兩組間差異有統計學意義(t=6.25，P＜0.05)。

圖1 外周血中Th17細胞表達水平

3 討論

本研究通過對鼻息肉患者外周血中Th17細胞的檢測發現，Th17細胞在鼻息肉患者外周血中表達較對照組患者顯著增高，且差異有統計學意義(P＜0.05)，據此推斷Th17細胞可能在鼻息肉的發病過程中起著重要作用，鼻息肉形成的具體過程自然與Th17細胞的功能密切相關。

Th17細胞是一種不同于Th1、Th2、Treg細胞的新型CD4+T淋巴細胞亞群，是固有T淋巴細胞在細胞因子TGF-β、IL-6、IL-1β和IL-23刺激下分化而來，其主要的效應分子為IL-17，IL-17家族有A～F六個成員[4]，其中IL-17(即IL-17A)與IL-17F生物學功能相似，二者通過與各種細胞表面的IL-17RA和IL-17RC結合，啟動相應靶基因轉錄，促使各種炎性因子的分泌，從而使局部炎性組織中性粒細胞、T細胞、DC等聚集，產生抗病原微生物作用，促進組織恢復正常[5]。在氣道炎癥性疾病中，IL-17能夠誘導氣道上皮細胞、內皮細胞及成纖維細胞分泌IL-1β、IL-6及GM-CSF，從而使中性粒細胞浸潤于病變部位，促使局部炎癥的持續[6]。

近年來，大量研究關注于Th17細胞或其分泌的主要效應分子IL-17與各種疾病發病機制之間的關聯性，認為Th17細胞在各種炎癥性疾病和自身免疫性疾病中都有較高水平表達，它的促炎作用是這些疾病發生的關鍵。在類風濕關節炎的發病過程中，Th17細胞正是通過誘導產生的多種細胞因子，使中性粒細胞，巨噬細胞及淋巴細胞聚集于滑膜，增強了局部炎癥反應，使關節破壞加重[7-8]。在系統性紅斑狼瘡(SLE)患者血清中IL-17顯著增高，并且在狼瘡性腎炎患者腎臟中檢測到高水平IL-17和IL-23，IL-17能夠促進B細胞的生存，并協同B細胞激活因子避免B細胞的凋亡，從而增加產生自身抗體的細胞的數目，這可能在SLE發病中占有重要作用[9-10]。據目前的研究發現Th17細胞在炎癥性腸病[11]，克羅恩病[12]，多發性硬化[13]的發病中也都發揮著一定的作用。這使耳鼻咽喉科的研究者們也致力于探測Th17細胞的特異性細胞因子IL-17A在本學科疾病中的作用，試圖通過影響Th17細胞的分化增殖去促使一些疾病的好轉或減少疾病的復發。在2004及2005連續兩年的研究中，王鑫等[14-15]發現在鼻息肉組織中IL-17及其受體表達增多，認為IL-17是導致鼻息肉發生的重要細胞因子。這為我們研究Th17細胞與鼻息肉提供了一定的基礎，由于Th17細胞分泌的炎性因子較多，我們實驗組通過流式細胞術直接對這種炎性細胞進行檢測，結果表明慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者外周血中Th17細胞較對照組有明顯增高，差異有統計學意義，認為Th17細胞分泌的促炎細胞因子通過外周循環到達鼻腔黏膜，與相應受體結合，誘發中性粒細胞和單個核細胞聚集，長期炎癥刺激導致鼻黏膜破壞、重塑，最終形成嚴重的息肉病變。

本研究僅簡單地對鼻息肉患者外周血中Th17細胞表達率進行了檢測，而關于其在鼻息肉形成過程中的具體作用環節還尚未明確，對此進一步的研究將為我們治療鼻息肉及防止其復發具有重要的臨床意義。

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Expression and significance of Th17 cells in patients with nasal polyps.

WANG Yue,MA Yong-ming,PU Xiao-ping.
Department of Otolaryngology,the Affiliated People's Hospital of Jiangsu University,Zhenjiang 212002, Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo detect the expression of Th17 cells in peripheral blood in nasal polyps,and to explore the role of Th17 cells in pathogenesis of nasal polyposis.MethodsThe peripheral blood samples were collected from 46 patients of chronic sinusitis with nasal polyp(CRSwNP,the study group)and 22 patients with simple nasal bleeding or nasal septum deviation(the control group).Flow cytometry was used to detect the expression levels of Th17 cells in peripheral blood in the two groups.ResultsThe levels of Th17 cells in the study group was(4.03%±0.69%),significantly higher than(1.35%±0.26%)in the control group(P＜0.05).ConclusionThe pathogenesis of CRSwNP may be involved in the increased expression of Th17 cells,and the detailed mechanisms should be further studied.

Nasal polyps;Th17 cells;Pathogenesis

R765.25

A

1003—6350（2015）15—2231—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.15.0805

2014-12-23)

鎮江市社會發展項目資助(編號：SH2013053)

馬永明。E-mail：maym121@163.com