中藥葛根微生物轉(zhuǎn)化菌株的鑒定及轉(zhuǎn)化特性的研究

宋艷秋，陳有為

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000；2.云南大學(xué)云南省微生物研究所，昆明 650091）

微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物代謝過程中產(chǎn)生的某個或某一系列的酶對底物進(jìn)行催化反應(yīng)〔1〕，具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)品少等優(yōu)點(diǎn)〔2〕。真菌在微生物中具有種類多、次生代謝產(chǎn)物多、并且具有分解多種營養(yǎng)物質(zhì)的強(qiáng)大酶類等特點(diǎn)。因而成為中草藥微生物轉(zhuǎn)化的主要功能菌。利用微生物轉(zhuǎn)化中草藥，與一般的加工方法相比能大幅改變藥性，提高療效，降低毒副作用〔3〕。

葛根Pueraria lobata為豆科植物野葛或粉葛的根，葛根的有效成分主要是異黃酮類化合物（如葛根素、大豆素、大豆苷等），總黃酮具有擴(kuò)張冠狀動脈、增加冠狀動脈血流量及降低心肌耗氧量等作用〔4〕。

在我國，葛根資源十分豐富，開展對中藥材葛根的微生物轉(zhuǎn)化研究，對提高其相關(guān)有效成分含量，產(chǎn)生新的活性成分，節(jié)省藥源，減輕毒副作用等方面都必將具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會意義。

通過反復(fù)篩選，獲得1株能夠較好轉(zhuǎn)化葛根有效成分的絲狀真菌，現(xiàn)將該菌株的分類鑒定結(jié)果及其轉(zhuǎn)化中藥葛根的前后化學(xué)成分和抑菌活性的變化報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 轉(zhuǎn)化菌株 分離自福建省古田縣紅曲米，編號YM3207，保存于云南大學(xué)微生物研究所。

1.1.2 葛根 云南產(chǎn)中藥，購于昆明市中藥批發(fā)市場，經(jīng)過云南省微生物研究所陳有為研究員鑒定為野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的根。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）固體斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

2）液體種子培養(yǎng)基：酵母膏肽，葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）。

3）固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（g/500 mL玻璃瓶）：葛根干粉、水磨食米粉各20 g，起始含水量（相當(dāng)于葛根干粉質(zhì)量）50%。

4）菌落觀察培養(yǎng)基：PDA平板培養(yǎng)基、察氏平板培養(yǎng)基、沙博弱氏培養(yǎng)基。

5）指示菌培養(yǎng)基：細(xì)菌類采用液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；皮膚致病真菌類采用沙博弱氏培養(yǎng)基；植物致病真菌采用PDA培養(yǎng)基。

1.1.4 指示菌

1.1.4.1 細(xì)菌 YM1011大腸埃希氏桿菌Escherichia coli；YM1028藤黃八疊球菌Sarcina lutea；YM1029白色葡萄球菌Staphylococcus albus；YM1033結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis。

1.1.4.2 皮膚致病真菌 YM3078皮炎單孢枝霉Hormodendrum dermatitidis；YM3096 疣狀毛癬菌Trichophyton verrucosum；YM3099犬小孢子菌Microsporumcanis。

1.1.4.3 植物致病真菌 YM3031木霉Thrichoderma；YM3032棒束梗霉Isaria。

上述供試指示菌均由云南大學(xué)省微生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)觀察 取菌種斜面上少量孢子，分別點(diǎn)植于PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、沙博弱氏培養(yǎng)基的平板上適當(dāng)位置。（28±2）℃靜置培養(yǎng)，觀察菌落特征〔5〕。另取培養(yǎng)7 d后的YM3207菌體在Olympus BH-2型光學(xué)顯微鏡和S-3000N型掃描電鏡下進(jìn)行形態(tài)特征觀察。

1.2.2 分子鑒定

1.2.2.1 菌株總DNA的提取 采用李紹蘭等〔6〕的方法。

1.2.2.2 PCR反應(yīng)及序列測定 PCR擴(kuò)增使用的引物采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1和ITS4。ITS1和ITS4序列分別為：

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）如下：PCR Buffer（×10，含20 mmol/L MgCl2）5 μL，10 mmol/L d NTP 4 μL，50 ng/μL DNA模板2 μL，5U Taq酶0.5 μL，50 pmol/L ITS1和50 pmol/L ITS4各2 μL，ddH2O 34.5 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min后進(jìn)入循環(huán)，94℃1 min；54℃1 min；72℃2 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，測序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2.3 ITS序列分析 將得到的ITS序列，用BLAST軟件與GenBank中已知的ITS序列進(jìn)行比對，用Clustal X〔7-8〕軟件完成多序列比對，并通過MEGA3.1軟件〔9-10〕中的 Kimura 2-parameter模型計(jì)算進(jìn)化距離，Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000次數(shù)據(jù)隨機(jī)抽樣計(jì)算Bootstrap值，以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。

1.2.3 微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 將活化好的斜面菌種接入三角瓶中（50 mL YPD培養(yǎng)基/200 mL三角瓶）（28±2）℃，200 r/min培養(yǎng)3 d，按10%的接種量接入固體轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基（40 g/500 mL玻璃瓶），于（28±2）℃靜置培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)結(jié)束后，于玻璃瓶中分別加入200 mL70%乙醇，浸提48 h，過濾，重復(fù)三次，合并浸提液，濃縮揮去乙醇得浸膏。

1.2.4 HPLC分析 色譜條件：根據(jù)文獻(xiàn)〔11〕，色譜柱為Symmetry?C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為甲醇-水梯度洗脫，洗脫條件見表1；檢測波長：250 nm；流速：0.4 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

參照物溶液制備：采用染料木素、葛根素為參照物，精密稱取，均制成濃度為1 mg/mL的參照物溶液。

樣品制備：精確稱取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物12.0 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇定容。采用上述的提取方法提取葛根干粉的有效成分，精確稱取葛根提取物11.3 mg置于10 mL容量瓶中，甲醇定容。

1.2.5 抑菌試驗(yàn)

1.2.5.1 樣品的制備 將葛根提取物、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別配制成5 mg/mL的水溶液。

1.2.5.2 指示菌的培養(yǎng) 取指示菌的新鮮斜面培養(yǎng)物分別接5 mL無菌水稀釋制成菌懸液。

1.2.5.3 濾紙片法（直徑為8 mm） 分別取各指示菌液0.2 mL，涂布于培養(yǎng)基表面，凝固后分別放入蘸有上述兩種樣品的無菌濾紙片，細(xì)菌和皮膚致病真菌置于37℃，植物病原真菌置于28℃，培養(yǎng)48 h后，分別測量抑菌圈直徑大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)及形態(tài)特征 菌株YM3207在察氏培養(yǎng)基上菌株生長不是很理想，4 d后出現(xiàn)較少的淡紅色菌絲，產(chǎn)紅色素比較明顯。PDA培養(yǎng)基上生長呈瘡疤狀，中間突起，24 h后，菌落為絨狀白色透明，48 h后，菌落漸變?yōu)榻埸S色至桔紅色，最終成紅紫色，背部邊緣色素明顯，呈深紅色，有細(xì)長規(guī)則的輻射狀褶皺。沙博弱氏培養(yǎng)基上氣生菌絲絨長，菌落初為白色，48 h后逐漸變?yōu)榻埸S色，最終為紅色，反面呈菊花狀輻射。

通過光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察，菌絲具橫隔，多核，分枝甚繁，且不規(guī)律，菌絲體不生成與營養(yǎng)菌絲區(qū)別的分生孢子梗。分生孢子著生于菌絲及分枝頂端，單生或者2～6個成鏈。閉囊殼球形，有柄，柄長短不一。在顯微鏡下用測微尺測得菌絲直徑約為3～7 μm，分生孢子球形或梨形，直徑約為6～9 μm，子囊孢子卵形或橢圓形，無色，閉囊殼25～35 μm。如圖1所示，綜合上述觀察研究結(jié)果，參照文獻(xiàn)〔12-13〕將菌株YM3207鑒定為紅曲霉屬M(fèi)onascus。

圖1 菌株YM3207的形態(tài)特征

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 對YM3207的ITS部分序列（535 bp）進(jìn)行測序，以ITS序列為基礎(chǔ)構(gòu)建了包括YM3207在內(nèi)的9株相關(guān)真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。在系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，菌株YM3207與Monascus purpureus（AY498578）在同一分支上，同源性在99.9%以上。綜上所述，通過菌株YM3207的菌落和顯微形態(tài)特征及ITS序列分析，將該菌鑒定為紫色紅曲霉Monascus purpureus。

圖2 菌株YM3207及從GenBank數(shù)據(jù)庫中調(diào)集的相關(guān)種構(gòu)建的以ITS序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 HPLC分析結(jié)果 由HPLC檢測圖可知，在該色譜條件下，葛根素的保留時間為7.693 min，染料木素的保留時間為41.334 min。相同色譜條件下，在葛根提取物（C）和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（D）的HPLC檢測圖中均可以找到相對應(yīng)的峰，并且峰形比較完整，峰1、峰2分別為葛根素和染料木素。見圖3。

通過計(jì)算可知，染料木素在葛根提取物中的百分含量是0.36%，而在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的含量為0.91%；葛根素在葛根提取物中的含量是4.1%，在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中的含量達(dá)到了11.3%，都相應(yīng)得到了提高。

2.4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果如表2所示，與葛根提取物比較，菌株YM3207轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抑菌活性有一定程度的增強(qiáng)，抗菌譜變廣。尤其是對細(xì)菌的抑制活性增強(qiáng)較為明顯。

3 討論

本研究通過固態(tài)轉(zhuǎn)化方式，對338株絲狀真菌進(jìn)行了反復(fù)篩選，最終得到一株能夠較好轉(zhuǎn)化葛根有效成分的絲狀真菌YM3207，通過對其菌落和顯微形態(tài)特征的觀察，發(fā)現(xiàn)其具有典型的紅曲霉屬的形態(tài)特征，并根據(jù)ITS序列結(jié)果最終將該菌株鑒定為紫色紅曲霉Monascus purpureus。

圖3 葛根素（A）、染料木素（B）、葛根提取物（C）、轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（D）的HPLC圖譜

表2 葛根提取物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

通過比較葛根乙醇提取物，菌株YM3207轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC圖譜，可以發(fā)現(xiàn)通過菌株YM3207的轉(zhuǎn)化作用，葛根的主要有效成分，在種類和量上發(fā)生了一定的變化，尤其是葛根素的含量得到了明顯的提高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔14-15〕，不同產(chǎn)地的葛根其葛根素含量有所不同，但一般都只能到3%～4%，現(xiàn)經(jīng)過微生物的轉(zhuǎn)化，葛根素含量達(dá)到了11.3%。

異黃酮具有抑制細(xì)菌和真菌作用，異黃酮的濃度對抑菌效果有很大的影響〔16-17〕。抑菌試驗(yàn)的結(jié)果從另一個方面表明，通過微生物的轉(zhuǎn)化作用，葛根中的一些化合物發(fā)生了變化，尤其是異黃酮類化合物相對含量得到提高，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抑菌活性較轉(zhuǎn)化前有一定程度的增強(qiáng)，抗菌譜變廣。

綜上所述，微生物轉(zhuǎn)化完全有可能使中藥中原來成分發(fā)生質(zhì)和量的變化，利用微生物的代謝作用來提高中草藥藥效是可能的。

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