胎兒生長受限胎盤及正常足月胎兒胎盤中激活素受體的表達水平及其臨床分析*

李雁 劉洪濤 李麗 陳春瑩

胎兒生長受限又稱之為宮內生長受限，胎兒出生體重明顯低于正常胎兒，是導致圍產兒死亡的主要原因，當前有關胎兒生長受限的研究有不少，一般認為與多種因素有關，胎盤在胎兒的發育中起到非常重要的作用，為分析胎盤中激活素受體對胎兒生長受限的影響，現分析胎兒生長受限激活素受體表達，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月-2014年8月本院婦產科分娩的產婦31例，依照患者分娩情況分為觀察組16例和對照組15例，觀察組胎兒生長受限，所有胎兒足月體重小于2500 g，Apgar評分大于8分，孕婦年齡（27.68±5.06）歲，BMI（18.37±5.09）kg/m2，產次（1.34±0.35）次；對照組患者分娩正常，足月胎兒出生體重大于2500 g，小于4000 g，Apgar評分大于8分，孕婦年齡（29.34±2.91）歲，BMI（21.63±3.61）kg/m2，產次（1.43±0.53）次。所有標本和資料均在獲得患者同意后獲取。兩組患者孕婦均為初產婦，自然受孕，無生殖器官疾病，排除高血壓患者、糖尿病患者、甲狀腺疾病患者、新生兒先天性疾病患者以及遺傳性疾病患者。

1.2 方法

1.2.1 胎盤組織HE染色 在患者胎兒分娩10 min后，剪去母體面胎盤組織，注意避免出血、鈣化區，采用生理鹽水沖洗干凈后采用福爾馬林液固定，并對兩組患者進行標記編號。

胎盤組織染色采用蘇木精-伊紅染色法，將組織取材固定2 d后，采用流水反復清洗，進行透明處理、圖蠟，放在EG-1160病例組織包埋機制成包塊，采用切片機連續切片，放在50 ℃溫水中貼片，并表上標簽，脫蠟至水，放入蘇木素染液中染色，將切塊放在鹽酸酒精溶液中，切塊變為淺紅色，在采用流水清洗，采用伊紅染色，再次經過脫水處理，放在二甲苯溶液中浸泡3 min封存，觀察胎盤切塊發育情況等[1]。

1.2.2 胎盤組織免疫組化染色 在患者胎兒分娩10 min后，剪去母體面胎盤組織，采用生理鹽水沖洗干凈后采用福爾馬林液固定，石蠟切塊與上述一致[2]。將石蠟切片經過脫蠟止水，加過氧化氫溶液，消滅細胞內源性過氧化酶的活性，放入PBS中浸泡5 min，自然冷卻，滴加一抗組織液，除去PBS液體，滴加A液50~100 μL，除去PBS液體，再滴加新鮮配制的DAB顯色液50~100 μL，觀察顯色，滿意后采用自來水清晰，采用蘇木素染色，脫水封裝[3]。

1.2.3 胎盤組織Real-Tine PCR檢測 在患者胎兒分娩10 min后，剪去母體面胎盤組織，注意避免出血、鈣化區，生理鹽水沖洗干凈后，放在-80 ℃水箱中保存[4]。將保存的標本取出，放在試管中，加入Trizol試劑1 mL，在冰浴中勻漿，轉移到EP試管中，加入氯仿溶液2 mL，置于冰中5 min，離心15 min，取上層液體，加入0.5 mL異丙酮/Trizol液，混合均勻后，靜置、離心，舍棄上清液，加入乙醇混合均勻后再離心，舍棄上清液，加入DEPC水50 μL。在紫外分光光度計上檢測，OD260/OD280在1.8~2.0范圍內為合格。調整RNA的濃度為0.5 μg/μL。實時定量熒光PCR測定中，先在95 ℃下預變性10 min，然后變性20 s，退火，結束后做溶解曲線。

1.3 評價標準 胎盤組織免疫組化染色結果在高倍顯微鏡下觀察切塊，細胞漿存在褐色顆粒為陽性，沒有著色為0分，著色為淺黃色為1分，著色為棕色為2分，顏色深至深棕色為3分。沒有觀察到陽性細胞為0分，觀察陽性細胞小于25%為1分，觀察陽性細胞在25~50%為2分，觀察陽性細胞大于50%為3分。實時定量熒光PCR測定中闕值定為0.8，相對表達量采用2-ΔCt[5]。

1.4 統計學處理 應用SPSS 22.0統計學軟件分析數據，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，計數資料比較采用字2檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胎盤組織HE染色 對照組胎盤組織絨毛發育良好，主要是合體滋養細胞，觀察組胎盤組織發育欠佳，存在較多絨毛內間質增生。

2.2 免疫組化染色 （1）對照組胎盤組織激活素受體ⅠA染色強度以（-）為主，無陽性染色，觀察組激活素受體ⅠA表達定位與對照組保持一致。（2）對照組胎盤組織激活素受體主要表現細胞滋養組織胞漿和合體滋養為主，染色強度主要表現為（-），無陽性表達，觀察組激活素受體ⅠB與對照組基本一致。（3）對照組激活素受體ⅡA表達以細胞滋養組織胞漿和合體滋養，觀察組激活素受體ⅡA表達定位與對照組表達一致，染色強度主要是（++~+++）。（4）對照組胎盤組織激活素受體ⅡB主要表達細胞滋養組織胞漿和合體滋養，染色強度以（-）為主，觀察組胎盤組織受體ⅡB表達定位與對照組基本一致，染色強度以（++~+++）為主。

2.3 激活素受體在兩組胎盤組織中的表達 兩組激活素受體ⅠA、ⅠB表達差異不明顯（P>0.05），觀察組ⅡA、ⅡB在（++），（+++）的百分比均高于對照組（P<0.05）；觀察組ⅡA、ⅡB在（-）的百分比顯著低于對照組（P<0.05），見表1。

2.4 胎盤組織中激活素受體基因的表達 觀察組胎盤組織激活素受體ⅠA、ⅠB基因表達與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05），觀察組胎盤組織ⅡA、ⅡB表達明顯高于對照組（P<0.05），見表2。

表1 激活素受體在兩組胎盤組織中的表達 %

表2 胎盤組織激活素受體基因相對表達量（x-±s） %

3 討論

胎兒生長受限是對圍生期嚴重并發癥之一，圍產兒死亡率非常高，一般認為胎兒生長受限后導致血管、胰腺等重要組織器官的永久性改變。當前有關胎兒生長受限的研究有不少，一般認為與多種因素有關，研究胎盤生長受限胎盤激活素受體的表達有非常現實的意義[5-6]。

在本研究中分析胎兒受限胎盤與正常足月胎兒胎盤組織病理，通過HE染色觀察發現，胎兒生長受限胎盤組織發育不佳，絨毛減少，鈣化增多，結果提示實驗組患者胎盤成熟與灌注不良有關。胎盤是母嬰至今物質交換的重要器官，對胎兒的發育起到了重要作用，胎兒的冰壁變化與并發癥的發生有很大關系。有研究指出胎盤主要是由絨毛間質、絨毛滋養細胞等構成，隨著妊娠時間的不同，胎盤逐漸出現不同的變化，正常足月人本身，絨毛組織主要由合體滋養細胞構成。胎兒生長受限會導致胎盤合體滋養細胞出現變化，胎兒生長受限胎盤組織合體滋養細胞凋亡明顯高于正常胎盤。在本研究中，結果與以往研究比較類似，推測胎兒生長受限的發生與胎盤發育不良有關[7]。

本實驗通過免疫組化方法，分析激活素4種受體的表達和檢測，結果表明胎盤組織激活素受體表達集中在細胞滋養細胞胞漿和合體滋養細胞中，也會在絨毛血管的內皮細胞中少量表達，這與近幾年的研究比較類似。近幾年很多研究表明妊娠晚期激活素受體主要來自于胎盤滋養細胞，四種激活素受體主要定位于胎盤絨毛血管的內皮細胞，本研究證實了這個觀點。胎兒生長受限胎盤組織中激活素受體ⅡA、ⅡB表達說明明顯高于對照組，細胞滋養細胞陽性染色最強[8]。有研究表明胎兒生長受限與滋養細胞的凋亡有關，在本試驗中在胎盤組織中定位激活素水平，結果表明胎盤中細胞凋亡的定位在絨毛滋養細胞層中，與以往研究類似，推測激活素受體可能具有調節絨毛滋養細胞凋亡作用，導致胎兒生長受限的發生[9]。

在本研究中重點分析激活素與胎兒生長受限的關系。通過免疫組化實驗方法和定量熒光PCR實驗方法相結合，分別從基因水平和蛋白對激活素水平在胎盤組織中的表達進行檢測，結果表明胎兒生長受限胎盤組織激活素受體ⅠA、ⅠB與對照組表達一致，胎兒生長受限胎盤組織激活素受體ⅡA、ⅡB表達明顯高于正常足月胎盤（P<0.05），推測激活素受體ⅡA、ⅡB參與胎兒生長受限的發生[8]。采用不同的研究方法分析激活素受體的表達，結果一致，推測胎盤組織中ActRII表達水平升高會促使胎兒生長受限[10-12]。在以往的研究中指出激活素A參與到滋養細胞分化進而影響胎兒生長發育，在研究中可以看出胎兒生長受限胎盤組織中激活素受體ⅡA、ⅡB明顯提高，推測與胎盤變化、血流密切相關[13-15]。

綜上所述，通過實時定量熒光PCR方法和免疫組化方法，定位和檢測激活素受體，胎兒生長受限患者胎盤激活素水平明顯要高于正常胎盤，激活素紊亂會導致胎兒生長受限。在研究中分析胎兒受限胎盤與正常足月胎盤激活素受體表達，采用免疫組化實驗方案和實時定量熒光PCR實驗結合，很好的將蛋白表達與細胞定位相結合，這種實驗方案具有更高的敏感性和特異性，能夠進行定位定量檢測，重復性好。胎兒生長受限的發病機制與多因素有關，在本研究中受到樣本量的限制，僅僅分析妊娠晚期胎盤，還需要分析不同妊娠時期胎盤激活素的表達。有研究表明母體血清中激活素A水平能夠預測胎兒生長受限疾病，在研究激活素受體表達中并未檢測母體血清和臍血中激活素的表達，血清和臍血激活素與胎盤中的表達相關性沒有準確的描述，在研究中排除了有合并癥的胎兒生長受限病例，樣本量很少，這方面還需要擴大樣本，進一步的完善。

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