青蒿琥酯對人結腸癌細胞HCT116和HT29的增殖與凋亡*

賈文斌 孫欣 杜志杰 郭建昇

結腸癌是西歐、北美等發達國家最常見的惡性腫瘤，也是我國九大常見惡性腫瘤之一。在過去30多年的時間里，包括我國在內的多數國家或地區結腸癌發病率呈上升趨勢。在我國因結腸癌死亡者，男性居惡性腫瘤死亡的第5位，女性居第6位。從流行病學的觀點看，結腸癌的發病與社會環境、生活方式（尤其是飲食習慣、缺乏體力活動）、遺傳因素有關。年齡、結直腸息肉史、潰瘍性結腸炎及膽囊切除史也是結腸癌的高危因素[1-2]。但總體而言，結腸癌的病因似不十分清楚。60%以上結腸癌患者被確診時已經失去根治手術機會，因此術后化療成為主要治療辦法，但化療藥物的毒副作用及患者自身的耐藥性是目前影響患者預后的相關因素。

青蒿素（artemisine）是從中藥黃花蒿中提取的有過氧基團的倍半萜內酯抗瘧新藥。青蒿素是中國發現的第一個被國際公認的天然藥物，在其基礎上合成了多種衍生物，如雙氫青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。青蒿素類藥物毒性低、抗虐性強，被WTO批準為世界范圍內治療腦型瘧疾和惡性瘧疾的首選藥物[3]。除上述作用外，還發現青蒿素對白血病、黑色素瘤、結腸癌、前列腺癌和乳腺癌細胞株高度敏感，有效抑制癌細胞的增殖[4]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥物 青蒿琥酯（廣西桂林南藥股份有限公司，批號：LA120306）

1.1.2 實驗儀器 CO2培養箱（Heal Force，型號：HP900），酶標儀（美國Thermo，型號：5250030），倒置顯微鏡（Olympus，型號：CKX41SF），流式細胞儀（美國B-D公司，型號：Facscalibur）。

1.1.3 實驗試劑 人結腸癌細胞株HCT116和HT29細胞來自于山西醫科大學細胞生理學省部共建教育部重點實驗室，10%無支原體小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：121004），噻唑蘭（Biotopped，批號：410C055），二甲基亞砜 （Solarbio，批號：302A035），DMEM高糖培養基（Hyclone，批號：NYF0905），0.25% 胰酶（Hyclone，批號：NWM0527），凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司，批號：130605）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人結腸癌CHT116和HT29細胞復蘇后采用RPMI 1640培養液、37 ℃、5%CO2培養箱中培養，2~3 d換液1次，取對數期生長細胞用于檢測。每組實驗重復3次。

1.2.2 MTT法檢測細胞抑制率 取對數生長期細胞，調整細胞懸液密度為5×104個/mL，每孔200 μL鋪于96孔板。培養24 h后細胞貼壁，棄去培養液，加入不同濃度（7.5、15、30、60、120 μg/mL）青蒿琥酯，每種濃度設5個復孔，每孔200 μL。同時設置空白孔（只加培養液）、陰性對照孔（只加細胞和培養液）。37 ℃、5%CO2：培養箱中分別培養48 h后棄去培養液，每孔加入20 μL MTT溶液（MTT質量濃度為5 mg/mL），繼續培養4 h后終止培養。棄去培養液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，于搖床低速振蕩10 min。在酶標儀490 nm波長處測量每孔的吸光度（A）值。整理數據后計算細胞抑制率，使用SPSS 13.0軟件計算IC50值。每組實驗重復5次。

細胞抑制率=[1-（實驗孔A值-空白孔A值）/（陰性對照孔A值-空白孔A值）]×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的細胞，調整細胞懸液密度為1×105個/mL，每孔l mL接種于6孔板，每孔各加1 mL培養液，吹打均勻后放入37 ℃、5%CO2培養箱培養。單層細胞鋪滿板底后，加入不同濃度的青蒿琥酯培養液（0、60、120 μg/mL），繼續培養24 h后收集細胞到10 mL離心管。每樣本細胞數為1×106個左右。離心半徑13.5 cm，1000 r/min離心5 min，棄去培養液，PBS 5 mL懸浮細胞。濾網過濾細胞懸液，離心半徑13.5 cm，1000 r/min離心5 min，棄去上清液加入500 μL的Binding Buffer懸浮細胞；加入5 μL Annexin V—FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫避光，反應5~15 min；在1 h內，用流式細胞儀進行觀察和檢測。每組實驗重復3次。

1.3 統計學處理 應用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 青蒿琥酯對細胞增殖的影響 人結腸癌細胞經不同濃度青蒿琥酯處理后，細胞生長受到不同程度的抑制（表1），且抑制程度隨著藥物濃度的增加而增強。不同濃度青蒿琥酯處理同種細胞后，抑制率間的差異具有統計學意義（P<0.05）；相同藥物濃度下兩種細胞之間抑制率的差異有統計學意義（P<0.05）。青蒿琥酯作用HCT119和HT29細胞48 h后的IC50值分別為57.34 μmol/L 和 26.64 μmol/L。

表1 不同濃度Art對HCT116和HT29的抑制作用比較（x-±s）%

2.2 青蒿琥酯對人結腸癌細胞凋亡率的影響 隨青蒿琥酯濃度升高，作用24 h后兩種人結腸癌細胞的凋亡率均逐漸上升，加藥組與陰性對照組凋亡率比較差異有統計學意義（P<0.05），見表2、圖1~6。

3 討論

目前手術、化療、放療仍是結腸癌治療的主要方法，但中藥因其獨特的生物調節功能也日益發揮著突出的作用。青蒿琥酯作為一種中藥成分，臨床上主要用于抗瘧疾方面的治療。近年發現其能發揮一定的抗腫瘤作用。Therese Ericsson等[5]長期臨床觀察發現青蒿琥酯在乳腺癌患者中治療中具有意義；Yang等[6]發現青蒿琥酯在細胞溶酶體中積累，促進溶酶體功能和鐵蛋白退化，然后導致線粒體ROS生產和最終的細胞死亡；Serkan Sertel等[7]經基因檢測得出5356的基因包含一個或多個結合位點的c-Myc/最大的上游該基因的位置，結論是c-myc和最大介導的轉錄控制基因表達可能有助于提高青蒿琥酯對癌細胞的治療效果；Wai等[8]提出ART相關的化合物具有強效

性與細胞周期相關；梅昕等[9]采用逆轉錄-聚合酶聯反應與酶聯免疫吸附法檢測得出青蒿琥酯可能通過抗炎及調節Treg/Th17平衡而發揮免疫作用；黃偉煒等[10]經細胞培養試驗發現青蒿琥酯可明顯抑制結腸癌HCT-8細胞的侵襲，其作用機制可能與其下調ICAM-1、VEGF165和Ang-2蛋白表達有關；朱天明等[11]提出青蒿琥酯能夠抑制人胃癌細胞GC-7901的增殖，促進其凋亡，Caspase 3蛋白的高表達在促進SGC-7901細胞凋亡中起著重要作用；劉亮等[12]研究表明Art誘導Ec9706細胞凋亡的機制可能是通過降低細胞線粒體膜電位，啟動內源性線粒體凋亡途徑，激活Caspase-3蛋白，從而誘導細胞凋亡；孫雅潔等[13]采用四甲基偶氮唑鹽法測定青蒿素、雙氫青蒿素、蒿甲醚和青蒿琥酯體外抑制人肺癌細胞、人胃癌細胞、人結腸癌細胞、人紅白血病細胞和人肝癌細胞的活性，認為青蒿素及其衍生物在體外對不同的腫瘤細胞有抑制活性作用；吳理茂等[14]檢測青蒿琥酯對拓撲異構酶的影響顯示，青蒿琥酯能提高DNA拓撲異構酶的活性，隨著濃度的提高作用漸趨明顯。本實驗通過運用不同濃度的青蒿琥酯干預兩種不同的人結腸癌細胞，發現其能抑制人結腸癌細胞的增殖。其抑制效應隨著劑量增加而逐漸增強，60 μg/mL濃度的青蒿琥酯處理人結腸癌HCT116和HT29細胞48 h后抑制率可達74%左右，呈劑量依賴效應。青蒿琥酯作用HCT116和HT29細胞48 h后兩種胃癌細胞的IC50值分別為57.34、26.64 μg/mL。表明青蒿琥酯對分化程度較低的人結腸癌細胞HCT116抑制作用較為明顯。運用流式細胞術檢測結果顯示藥物處理24 h后兩種人結腸癌細胞凋亡率逐漸上升，呈劑量依賴效應，與對照組相比差異有統計學意義。

表2 不同濃度青蒿琥酯處理兩種人結腸癌細胞24 h后的細胞凋亡率 %

圖1 HCT116細胞陰性對照

圖2 HCT116細胞30 μg/mL

圖3 HCT116細胞60 μg/mL

圖4 HT29細胞陰性對照

圖5 HT29細胞30 μg/mL

圖6 HT29細胞60 μg/mL

青蒿琥酯不但在抑制癌細胞增殖及誘導細胞凋亡方面方面廣受關注，而且還有報道指出青蒿琥酯可逆轉腫瘤細胞多藥耐藥等作用[15-16]。術后化療現在仍作為治療中晚期結腸癌必不可缺的治療手段之一，而現在腫瘤藥物耐藥性及副作用日趨明顯，本試驗通過對青蒿琥酯對人結腸癌細胞HCT116和HT29的增殖與凋亡，為青蒿琥酯在臨床抗腫瘤應運提供可能，為今后關于結腸癌治療的基礎和臨床研究提供一定的思路和方法。

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