辣椒素受體在大鼠坐骨神經損傷再生過程中的作用研究*

張宏 齊超 錢貝 劉俊肖 張華 喬曉玲 李夏青

辣椒素受體（Capsaicin receptor）是一種可被辣椒素激活的非選擇性陽離子通道，屬于瞬時感受器電 位 通 道（transient receptor potential channels， TRP channels）家族，又稱為瞬時受體電位香草酸受體1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）。 由Aδ類和C類神經纖維支配的組織幾乎都有TRPV1分布[1]，TRPV1可被辣椒素、熱刺激、低pH和源于多巴胺的內源性脂質激活，被認為是有害物理、化學刺激信號的整合器，也稱之為傷害性感受器（noxious sensor）。目前認為，TRPV1主要參與痛覺的傳導，與痛覺的產生和痛覺增敏密切相關。然而，也有文獻[2]報道TRPV1與CGRP、TrkA等與神經再生有關的物質存在密切關系。因此推測TRPV1有可能參與/干預神經損傷與再生過程。為此本研究基于坐骨神經壓榨性損傷的在體模型，在損傷前給予TRPV1阻斷劑以觀察TRPV1對坐骨神經壓榨性損傷后再生過程的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源 中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供SPF級SD大鼠24只，體重（190±10）g，許可證編號SCXK（軍）2007-004。

1.1.2 主要試劑和儀器來源 AMG-517（Selleck Chemicals，USA），微量注射器（上海注射器三廠提供），甲苯胺藍（北京化工廠提供），光學顯微鏡（Olympus，日本），戊二醛、鋨酸、二甲胂酸鈉由本校中心實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 雄性SD大鼠（180~200 g）24只，隨機分為單純損傷組和給予拮抗劑組（AMG517組），每組12只，每組均設1周、2周時間段。1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉。其中，給予拮抗劑組于損傷前1 h用微量注射器于右后肢足底皮下注射AMG517（300 μg/kg）[3]；單純損傷組于損傷前于右后肢足底皮下按同等標準注射生理鹽水。右后肢脫毛、消毒，股部行縱形切口切開皮膚約1.5 cm，延肌間隙分離筋膜、肌肉，暴露坐骨神經，在距梨狀肌下緣5 mm處用止血鉗夾閉坐骨神經60 s。逐層縫合后單獨飼養。

1.2.2 標本的制備 在預計的觀察時間點麻醉動物，除去雙后肢被毛，行股后部縱形切口切開皮膚，分離筋膜、肌肉，充分暴露并游離坐骨神經，從梨狀肌下緣至坐骨神經分叉處將其剪下，右側再分別分為近、中、遠約0.5 mm各三段，放入4%戊二醛中，4 ℃條件下放置3 h后，放入0.1 mol/L二甲胂酸鈉（pH=7.3）漂洗5次，1%鋨酸固定2 h，雙蒸水漂洗后梯度酒精脫水。環氧樹脂包埋。

1.2.3 半薄切片制作及甲苯胺藍染色 使用超薄切片機上分別對所取標本連續切取8~10張1 μm橫切面（其中右側標本均于靠近損傷部位切?。旁诘斡?滴蒸餾水的干凈載玻片上，酒精燈烘干，滴加1%甲苯胺藍染液，間斷加熱至染液微干，洗瓶沖洗掉多余染液，濾紙吸去多余水分，晾干后中性樹脂封片。

1.2.4 神經纖維計數 染色后Olympus顯微鏡觀察，JVC顯微攝像儀攝取圖像。每個標本選取6張橫切面記數神經纖維數目。

1.3 統計學處理 采用graph-pad prism 5.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以（±s）表示，比較采用ANOVA檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 正常坐骨神經半薄切片特征 神經纖維髓鞘密集，排列規則?？傮w特征見圖1。

2.2 坐骨神經壓榨性損傷后神經纖維數量變化 損傷近端與正常坐骨神經相比，神經纖維數量減少。損傷中心及損傷遠端在損傷1周后可見大量髓鞘崩解產物和炎細胞浸潤，2周后可見施萬細胞（Schwann cell）包繞的新生有髓纖維。見圖2~4、表1。

2.3 損傷前給予AMG517對神經軸突再生的影響損傷前給予AMG517，術后2周時，神經纖維數目多于單純損傷組（P<0.01），且排列規則。術后1周時，損傷前是否給予AMG517對神經纖維數目無明顯影響（P>0.05）。見圖2~4、表1。

圖1 健側坐骨神經半薄切片甲苯胺藍染色（×1000）注：圖1A、1B為單純損傷組，圖1C、1D為給予拮抗劑再損傷組；圖1A、1C為術后1周，圖1B、1D為術后2周

表1 各組神經纖維數目（x-±s） 個

圖2 坐骨神經損傷近端半薄切片甲苯胺藍染色（×1000）注：2A、2B為單純損傷組，2C、2D為給予拮抗劑再損傷組；2A、2C為術后1周，2B、2D為術后2周；損傷近端損傷后2周神經纖維數目與1周相比差異不明顯；相同時間點上，單純損傷組與給予拮抗劑組神經神經纖維數目差異不明顯

圖3 坐骨神經損傷中心半薄切片甲苯胺藍染色（×1000）注：3A、3B為單純損傷組，3C、3D為給予拮抗劑再損傷組；3A、3C為術后1周，3B、3D為術后2周；術后1周時，損傷中心可見大量髓鞘崩解產物和炎細胞浸潤；術后2周時，給予拮抗劑組的神經神經纖維數目多于單純損傷組，且排列較為規則

圖4 坐骨神經損傷遠端半薄切片甲苯胺藍染色（×1000）注：4A、4B為單純損傷組，4C、4D為給予拮抗劑再損傷組；4A、4C為術后1周，4B、4D為術后2周；術后1周時，損傷遠端可見大量髓鞘崩解產物和炎細胞浸潤；術后2周時，給予拮抗劑組的神經神經纖維數目多于單純損傷組，且排列較為規則

由表1可以得出，健側、損傷近端各組比較差異無統計學意義（P>0.05）；損傷中段：單純損傷組1周與2周、AMG517組1周與2周、單純損傷2周與AMG517組2周，兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.01），后者神經纖維數目多于前者，其余組別間無統計學差異（P>0.05）；損傷遠端：單純損傷組1周與2周、AMG517組1周與2周、單純損傷組2周與AMG517組2周，兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.01），后者神經纖維數目多于前者，其余組別間無統計學差異（P>0.05）。

3 討論

辣椒素受體（TRPV1）屬于TRP通道家族，是TRPV子族的首位成員，也是哺乳動物6種熱敏通道之一。它有6個跨膜區，其中在第5和第6個跨膜區之間有一個短的孔狀疏水結構，此結構參與并調控了辣椒素激活 VR1 的過程。其氨基末端的親水區（432個氨基酸）包含了一個脯氨酸富集區，其連接了3個鉤狀重復區域，據推測可能參與了受體蛋白之間的相互作用；羧基末端（154個氨基酸）包含了一些不可識別的基序[4]。

研究發現，由Aδ類和C類神經纖維支配的組織，幾乎都有TRPV1分布，包括神經系統、呼吸系統、消化系統、心腦血管系統和泌尿等系統。如腦內的大腦皮質、下丘腦和背側丘、小腦皮質、紋狀體、嗅核、中腦、嗅球、腦橋、藍斑、海馬和導水管周圍灰質等腦區，以及脊髓和感覺神經節（背根神經節和三叉神經節）都有表達[5]。除辣椒素外，TRPV1還可被熱刺激（≥43 ℃）以及多種化學物激活，包括內源性大麻素、大麻素、外用止痛藥、崁酮、胡椒堿、蒜素。有害性化學物質或熱刺激引起的TRPV1介導的陽離子流，會因為低pH值而得到加強。實際上，與損傷相關的組織酸中毒（pH≤5.9）這一特征性狀態，會引起TRPV1熱活化閾值的改變，所以TRPV1才會在室溫狀態下被激活。TRPV1活化閾值的改變和辣椒素介導的反應的增強也可由酒精、尼古丁、炎癥細胞因子引起。此外，緩激肽、神經生生長因子等一些促進痛覺形成的物質，可以活化磷脂酶C，繼而引起的PIP2水平下降以及PKC介導的對TRPV1受體的磷酸化作用，兩者均可使TRPV1的活性增強。所以，TRPV1是一個多種信號的整合器，可以轉換由多種傷害性刺激誘發產生的信號[6]。一些TRPV通道的功能受到嵌入或停留在漿膜的調節。TRPV1與神經胞吐蛋白（SNARE）依賴的胞吐途徑中的一些成分相互作用，這些相互作用可以促進PKC介導的TRPV1向胞膜的遷移。而且，促痛因子如神經生長因子可通過酪氨酸激酶介導的對TRPV1的酪氨酸磷酸化作用促進TRPV1向胞膜表面的嵌入[7]。最近有研究發現，TRPV1與突觸前、突觸后蛋白質共存于脊髓皮質神經元中，并能影響脊髓形態。而且，TRPV1存在于內生的突觸小體里。在背根神經節來源的一種細胞系里，TRPV1富集于細長的絲狀偽足以及細胞接觸部位。而且在突觸的轉運小體、絲狀偽足的傳輸小泡中、神經突中也檢測到TRPV1。TRPV1的激活可快速調節這些囊泡的循環和融合，使得絲狀偽足結構得到快速重組。說明TRPV1參與了神經網絡的形成、突觸調節、神經遞質釋放等過程[8]。而且TRPV1跟降鈣素基因相關肽（CGRP）、神經營養因子受體（TrkA）等與神經再生有關的物質存在密切關系。因此推測TRPV1可能參與了神經再生。已經證實CGRP與感覺信息，特別是傷害性刺激信息的傳入與整合關系密切、是參與疼痛信號傳導的主要分子之一，且實驗也已證實CGRP與TRPV1免疫共定位于Aδ與C纖維的感覺神經細胞[2]。近10多年CGRP在神經損傷及再生過程中的作用受到了廣泛重視。周圍神經壓榨損傷后，殘留的未損傷神經纖維及相應背根神經節細胞（Dorsal root ganglia， DRG）CGRP的表達上調[9]，這種上調提示CGRP可能參與了早期向中樞傳遞損傷信號并可能參與激活或誘導神經再生的信號轉導機制。表達CGRP的DRG神經元中有84%同時可以表達TrkA；大多數CGRP免疫熒光陽性神經元也同時為TRPV1陽性[10]。全身應用辣椒素可使感覺神經元CGRP大量釋放而耗竭同時伴有TrkA表達下降，這種現象可通過給予NGF后逆轉[11]。有人提出TRPV1激活所引起的鈣調素依賴性蛋白激酶/cAMP反應元素結合蛋白（Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases Ⅱ/cAMP responsive element binding protein，CaMK Ⅱ/CREB）磷酸化的增加是導致感覺神經元CGRP合成增加的機制之一[12]。而NGF通過其受體-TrkA促神經元存活及神經突起再生的信號機制目前認為主要與有絲分裂原激活的蛋白激酶（The mitogen-activated protein kinases，MAPKs） 信號通路蛋白ERK1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2）及 JNLs（c-Jun N-terminal kinases）的磷酸化增強有關[13]；也有人認為非鈣依賴性磷酸肌醇酯-激酶（3phosphoinositide-3 kinase，PI3K）及其相關下游信號通路蛋白（Akt/PKB）的激活也是神經營養因子促使神經再生及分支的機制之一[14]。

辣椒素受體作為一種多型信號探測器及多種疼痛感受器，雖然上世紀末才被成功克隆，卻因其生物學特點，成為現今最受關注、得到研究最為廣泛的非選擇性陽離子通道之一，以其為靶點的臨床藥物研究也同樣開展廣泛[15]。本實驗采用坐骨神經壓榨性損傷在體模型，觀察使用或不使用TRPV1拮抗劑阻斷該受體前提下，受損神經的不同修復情況，以探討其對神經損傷后再生的影響。本實驗表明，在阻斷TRPV1的條件下，再生有髓神經纖維數目多，排列規則?？梢娮钄郥RPV1有利于大鼠坐骨神經壓榨性損傷后的修復。

可以提出以下設想：神經損傷局部由于各種傷害性物質的產生可導致TRPV1體激活；激活的TRPV1可通過與TrkA相似的細胞內信號轉導機制MEK/MAPK-ERK或PI3K/Akt（PKB）等影響包括CGRP在內的與軸突再生有關的細胞結構合成及表達增加，以此參與神經再生過程。實驗結果提示，作為新一代鎮痛藥物的TRPV1拮抗劑，是否有可能在臨床應用中作為有利于神經損傷后修復的藥物來使用。

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