手性高效液相色譜法測定恩替卡韋中對映異構體雜質

歐陽婷，楊小玲，麥曦，馬惠玲，程帆，羅恒真，劉陽，劉斌

1.南昌大學藥學院，南昌 330006；2.江西青峰藥業有限公司，贛州 341000

恩替卡韋(Entecavir) 的化學名為2-氨基-9-[(1S，3R，4S)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲基環戊基]-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮，恩替卡韋是一種能有效抑制乙肝病毒復制的脫氧鳥嘌呤核苷類似物，可通過抑制乙肝病毒DNA聚合酶而抑制病毒DNA復制過程中的啟動和延長步驟，對乙肝病毒的復制從起始階段、逆轉錄期和DNA依賴性DNA合成期的三個階段起抑制作用[1,2]。與其他核苷類化合物如拉米夫定(Lamivudine)、噴昔洛韋(Penciclovir)和洛布卡韋(Lobucavir)相比較，Enetcvair具有更高抗HBV活性(hepatitis B virus，HBV)[3]；而且長期應用耐藥的發生率較低，同時還具有劑量小、安全性高等優點[4]。

恩替卡韋為手性藥物，分子中有三個手性中心，其有效的構型為1S，3R，4S，但在合成過程中可能引入各種光學異構體雜質，包括非對映異構體雜質和對映異構體雜質，其主成分及主要雜質結構式見圖1，非對映異構體雜質主要通過反相高相液相色譜法(RP-HPLC)進行限量檢查，但是RP-HPLC難以分離對映異構體雜質，故本文建立手性高效液相色譜法檢查恩替卡韋中對映異構體雜質限量的方法，為保證本品的安全性、有效性提供了方法依據。

圖 1 恩替卡韋及主要光學異構體雜質結構Fig 1 The structures of entecavir and principal optical isomer impurities

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

日本島津LC-10AT高效液相色譜儀及SPD-10A紫外檢測器，正已烷及乙醇均為色譜純，恩替卡韋對照品(純度：99.7%，江西青峰藥業有限公司提供)，恩替卡韋對映異構體對照品(純度：99.5%，江西青峰藥業有限公司)，恩替卡韋六批原料(批號分別為：20150104、20150114、20150201、20150305、20150316、20150414，江西青峰藥業有限公司)。

1.2 色譜條件 色譜柱為CHIRALPAK AD-H柱(日本Daicel化學工業公司，填料為表面涂敷了直鏈淀粉-三[3，5-二甲基氨基甲酸酯]的球形硅膠，規格：4.6×250mm，5μm)；流動相：正己烷-乙醇(55∶45)；流速：1.0mL/min；檢測波長：254nm；進樣量：20μL；柱溫：25℃。

1.3 溶液制備 供試品溶液：取本品約25mg，精密稱定，置25m L量瓶中，加流動相適量，超聲使溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取10mL，置100mL量瓶中，加流動相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

對照溶液：精密吸取1.0m L供試溶液，置100mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得。

對映異構體對照品溶液：精密稱取對映異構體(1R，3S，4R)對照品約5mg，置100mL量瓶中，加流動相適量，超聲使溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0mL，置100mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

混合對照品溶液：分別取恩替卡韋、對映異構體(1R，3S，4R)適量，用流動相溶解并稀釋制成每1ml中約含恩替卡韋0.1mg 和約含對映異構體(1R，3S，4R)0.5μg的混合溶液。

圖 2 恩替卡韋對映異構體紫外吸收光譜Fig 2 The ultraviolet absorption spectrum of entecavir enantiomer

2 結果與討論

2.1 測定波長的選擇 取恩替卡韋對映異構體對照品溶液在200～400nm間進行光譜掃描，掃描圖譜見圖2，結果顯示恩替卡韋對映異構體在254～256nm波長處有最大吸收，故選擇254nm為測定波長。

2.2 空白溶劑試驗 取流動相20μL注入液相色譜儀，按1.2項下色譜條件進行檢測，結果見圖3，結果表明流動相對恩替卡韋的異構體檢查沒有干擾。

圖 3 空白溶劑色譜圖Fig 3 HPLC chromatograph of blank solvent

2.3 系統適用性試驗 取1.3項下的恩替卡韋、對映異構體混合對照品溶液作為系統適用性溶液，按1.2項下色譜條件進行檢測，結果見圖4，出峰順序依次為：對映異構體，恩替卡韋，二者的分離度符合要求。

圖 4 系統適用性試驗色譜圖Fig 4 HPLC chromatograph of system suitability

表 2 穩定性試驗結果Tab 2 The results of stability test

2.4 檢測限 取恩替卡韋對映異構體適量，用流動相溶解并逐級稀釋，按3倍的信噪比計算，最低檢測限為1ng。

2.5 精密度試驗 取1.3項下的恩替卡韋、對映異構體混合對照品溶液20μL注入液相色譜儀進行測定，連續平行分析6次，記錄對映異構體的峰面積，結果見表1，結果表明方法的精密度良好，方法可行。

2.6 穩定性試驗 取1.3項下的恩替卡韋、對映異構體混合對照品溶液20μL，分別在0，1，2，4，6，8小時注入液相色譜儀，測定峰面積，結果見表2，結果表明恩替卡韋主成份和對映異構體在流動相溶液中放置8小時穩定性良好。

2.7 樣品中對映異構體雜質測定 各批樣品均按“1.3”項下的方法制備成供試品溶液和對照溶液，取對照溶液20μL注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成份色譜峰的峰高為滿量程的10%；再精密量取供試品溶液和對照溶液20各μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如有與恩替卡韋對映異構體保留時間一致的色譜峰，其峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.2倍(0.2%)。結果6批樣品均未檢出對映異構體雜質。

[1] Han SB. Natural course, therapeutic options and economicevaluation of therapies for chronic hepatitis B[J]. Drugs, 2006, 66(14): 1831-1851.

[2] Buti M, Esteban R. Drugs in development for hepatitis B[J]. Drugs, 2005, 65(11): 1451-1460.

[3] 陳琨, 歐陽貴平, 任志堯, 汪春梅, 楊金志. 核苷類抗乙肝病毒藥物研究最新進展及其合成方法[J]. 精細化工中間體, 2008, 38(2): 17-22.

[4] Chang T T, Gish R G, Robert G G, et al. A Comparison of Entecavir and Lamivudine for HBeAg-Positive Chronic Hepatitis B[J]. New Eng J Med, 2006, 354(10): 1001-1010.

[5] 國家藥典委員會, 中華人民共和國藥典, 四部. 北京: 中國醫藥科技出版社, 2015: 107.