Notch2/Hes-1信號通路活化參與調控腎缺血-再灌注誘導炎癥因子的表達研究*

黃仁發，賴虹伊，梁群卿，黃國東，向少偉，汪東濤，馬曉露，黃海燕，胡維，林心如，周巧玲

（1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院 腎內科，廣西 南寧530011；2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧530023；3.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院 健康管理中心，廣西 南寧530011；4.中南大學湘雅醫院 腎內科，湖南 長沙410008）

前期研究表明，腎缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）可誘導大鼠血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factorsα，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）表達增多，腎小管上皮細胞單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）表達上調，證實腎IRI存在炎癥過程，腎小管上皮細胞在腎IRI時可轉化為炎癥細胞[1]。但這種轉化的信號機制是什么？本研究應用Notch信號關鍵酶γ-泌肽酶（γ-secretase）抑制劑DAPT阻斷Notch信號通路活化后，觀察Notch2/Hes-1信號通路活化是否參與調控腎缺血-再灌注（IR）誘導腎小管上皮細胞轉化為炎癥細胞的過程。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取10～12周齡健康雄性清潔級SD（sprasue-dawley）大鼠，體重（210±34）g，共45只，購自上海斯萊克景達實驗動物有限公司長沙分公司，動物合格證號：SCXK（湘）2009-0004，于湘雅醫學院實驗動物學部飼養。在室溫18～25℃，相對濕度50%～60%，人工12 h晝/夜循環照明環境中，用全價營養，分籠飼養。每日定時清洗籠舍，大鼠自由攝食及飲水。

1.1.2 DAPT的配置方法 5 mg的DAPT加入DMSO 1ml溶解，配制溶度為10mol/L（5mg/ml）的儲存液。實驗前根據大鼠體重取適量儲存液，每次灌胃前加入生理鹽水，配制總體積為2ml的工作液。工作液使用前在超凈工作臺配制。

1.1.3 主要的儀器和試劑 BX-50生物光學顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡（德國Carl Zeiss），γ-secretase抑制劑DAPT（5mg，美國Sigma公司），蛋白提取試劑盒（上海申能博彩生物技術公司），BCA蛋白定量試劑盒（江蘇碧云天生物技術公司，PMSF（江蘇碧云天生物技術公司），PDVF膜（蘇州廣惠科技有限公司），大鼠TNF-α ELISA kit和大鼠IL-6 ELISA kit（美國BPB Biomedical公司），兔抗大鼠MCP-1（武漢博士德生物技術有限公司），兔抗大鼠Notch2多克隆抗體、兔抗大鼠Hes-1多克隆抗體和FITC標記的山羊抗兔IgG（美國Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立與分組 實驗動物術前禁食12 h，自由進水，術前用10%水合氯醛溶液（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉。沿腹部正中線切口，逐層切開分離皮膚、肌肉、腹白線進入腹腔后，切除右側腎臟（作為正常組大鼠腎組織），于結腸脾曲外側切開后腹膜，暴露左側腎臟，游離左輸尿管和腎上腺避免損傷，再游離左腎蒂。穩定10min后將大鼠隨機分成3組，每組15只，持續夾閉左腎動脈60min后恢復灌注。缺血-再灌注組（I/R組）恢復灌注后予以生理鹽水[2ml/（d·只）]灌胃；γ-secretase抑制劑組（DAPT組）恢復灌注后予以γ-secretase抑制劑DAPT[500μg/（100 g/d）]灌胃；假手術組（Sham組）分離腎蒂但不夾閉左腎動脈，術后予以生理鹽水[2ml/（d·只）]灌胃。3組在灌注后24、48和72 h各處死大鼠5只。

1.2.2 檢測各組大鼠腎功能、血清TNF-α、IL-6水平 全自動生化儀檢測大鼠腎功能，ELISA法檢測各組大鼠血清TNF-α、IL-6水平。

1.2.3 各組大鼠腎臟病理改變 取左側腎臟置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液，將標本依次行固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟，HE染色，每張切片在高倍鏡下取外髓質部10個視野，作半定量分析并計算均值[2]：無病變為0分；病變≤10%為1分；11%～25%為2分；26%～45%為3分；46%～75%為4分；病變>75%為5分。光學顯微鏡下（×20）觀察各腎臟標本病理切片的形態改變，分析各組大鼠腎小管病理損傷程度。

1.2.4 激光共聚焦免疫熒光法檢測各組大鼠腎組織Notch2、Hes-1、MCP-1蛋白的表達 冷凍切片95%固定，PBS沖洗，1%Triton透膜，羊血清工作液封閉，分別滴加Notch2多克隆抗體（1∶150）、Hes-1多克隆抗體（1∶150）、MCP-1多克隆抗體（1∶150），4℃孵育過夜，然后分別滴加FITC標記（綠色熒光）的山羊抗兔IgG（二抗，1∶500），50%緩沖甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝像。

1.2.5 W estern blot檢 測 腎 組 織Notch2、H es-1、MCP-1蛋白的表達 取新鮮腎組織50～100mg提取總蛋白后，測蛋白濃度，經過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，Notch2多克隆抗體（1∶300）、Hes-1多克隆抗體（1∶300）、MCP-1多克隆抗體（1∶300）孵育過夜，辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG孵育（用含0.5%脫脂奶粉的TBET稀釋1∶10 000），最后用化學發光得到膠片，蛋白條帶用凝膠光密度分析軟件測其OD值，用β-actin蛋白作為內參照，通過計算比值（OD目的蛋白/ODβ-actin蛋白），即目的蛋白的表達量來分析目的蛋白表達的相對水平，分析兩組大鼠腎組織Notch2、Hes-1、MCP-1蛋白的表達。

1.3 統計學方法

采用SPSS 15.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，如方差齊，組間比較用方差分析及LSD多重比較；如方差不齊，則用非參數檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠尿素氮和血肌酐水平比較

生化結果顯示，Sham組大鼠尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）水平無明顯升高。而IR后大鼠腎功能明顯受損，術后BUN、Scr水平升高，24h達到高峰，48和72h逐漸降低。與相同時間Sham組比較，24、48和72 h I/R組大鼠BUN、Scr水平升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。經DAPT處理后，與相同時間I/R組比較，大鼠24、48和72 h BUN、Scr水平顯著下降，差異均有統計學意義（P<0.01）。見表1、2。

表1 3組大鼠BUN水平比較 （n=5，mg/dl，±s）

表1 3組大鼠BUN水平比較 （n=5，mg/dl，±s）

注：1）與Sham組比較，P<0.01；2）與I/R組比較，P<0.01

組別 24 h 48 h 72 h Sham組 14.62±3.02 13.93±4.11 13.92±3.92 I/R組 50.44±6.621） 45.87±4.981） 31.77±6.001）t值 10.610 7.340 8.281 P值 0.000 0.000 0.000 DAPT組 46.03±5.112） 38.49±7.392） 25.13±6.482）t值 4.473 4.652 4.335 P值 0.002 0.001 0.005

表2 3組大鼠Scr水平比較 （n=5，mg/dl，±s）

表2 3組大鼠Scr水平比較 （n=5，mg/dl，±s）

注：1）與Sham組比較，P<0.01；2）與I/R組比較，P<0.01

組別 24 h 48 h 72 h Sham組 0.41±0.08 0.40±0.09 0.42±0.08 I/R組 3.91±0.361） 3.26±0.361） 2.32±0.261）t值 11.330 7.126 6.985 P值 0.000 0.000 0.000 DAPT組 3.33±0.282） 2.63±0.272） 1.70±0.322）t值 4.058 4.115 4.231 P值 0.005 0.003 0.002

2.2 大鼠腎臟病理改變

Sham組大鼠腎小球、腎小管間質均未見明顯病變；I/R組大鼠腎小管病變以皮髓交界處最為明顯，可見刷狀緣丟失、基底膜裸露、小管擴張、管腔內管型形成、間質炎癥細胞浸潤及小管上皮細胞再生等病變。經DAPT處理后，腎小管結構較I/R組明顯完整清晰，管腔內容物較I/R組減少，炎癥細胞浸潤較I/R組明顯減輕。腎小管間質半定量評分顯示，與相同時間Sham組比較，I/R組腎小管間質評分明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。與相同時間I/R組比較，DAPT組大鼠腎小管間質評分明顯降低，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖1和表3。

2.3 大鼠血清腫瘤壞死因子-α 和白介素-6表達比較

結果顯示，腎IR誘導血清IL-6和TNF-α 水平顯著升高，再灌注后24 h達最高峰，之后逐漸下降，但72h仍高于Sham組，與相同時間Sham組比較，差異有統計學意義（P<0.01）；經DAPT處理后，與相同時間I/R組比較，大鼠血清IL-6和TNF-α 水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。見表4、5。

2.4 大鼠腎組織Notch2、Hes-1、MCP-1蛋白表達比較

圖1 3組大鼠腎臟病理改變 （HE染色×20）

表3 3組大鼠腎小管間質半定量評分比較 （n=5，±s）

表3 3組大鼠腎小管間質半定量評分比較 （n=5，±s）

注：1）與Sham組比較，P<0.01；2）與I/R組比較，P<0.01

組別 24 h 48 h 72 h Sham組 0.38±0.16 0.36±0.24 0.32±0.13 I/R組 3.52±0.221） 2.70±0.231） 2.32±0.311）t值 12.053 8.659 7.085 P值 0.000 0.000 0.000 DAPT組 2.78±0.332） 1.90±0.212） 1.06±0.402）t值 4.121 4.132 5.231 P值 0.002 0.002 0.001

表4 3組大鼠血清IL-6水平比較 （n=5，pg/L，±s）

表4 3組大鼠血清IL-6水平比較 （n=5，pg/L，±s）

注：1）與Sham組比較，P<0.01；2）與I/R組比較，P<0.01

組別 24 h 48 h 72 h Sham組 782.23±99.19 739.84±152.42 754.65±107.71 I/R組 3 749.26±588.921） 3 000.87±381.761） 1 286.43±215.381）t值 15.067 13.613 8.257 P值 0.000 0.000 0.000 DAPT組 2 179.62±391.942） 1 735.47±422.352） 849.45±157.132）t值 8.144 7.562 4.835 P值 0.000 0.000 0.002

表5 3組大鼠血清TNF-α 水平比較 （n=5，pg/L，±s）

表5 3組大鼠血清TNF-α 水平比較 （n=5，pg/L，±s）

注：1）與Sham組比較，P<0.01；2）與I/R組比較，P<0.01

組別 24 h 48 h 72 h Sham組 112.92±47.95 108.21±36.63 113.56±39.58 I/R組 2 071.08±391.811） 1 758.44±158.051） 647.26±164.571）t值 12.053 8.659 7.085 P值 0.000 0.000 0.000 DAPT組 1 557.81±237.252） 1 155.25±262.832） 173.97±111.132）t值 4.121 4.132 5.231 P值 0.002 0.002 0.001

免疫激光共聚焦結果表明，Sham組大鼠腎小管未見Notch2陽性蛋白表達，可見少量的Hes-1和MCP-1陽性蛋白表達，腎IR后24 h可見腎小管大量的Notch2、Hes-1和MCP-1陽性蛋白表達，尤其以受損的遠端腎小管熒光最強，48 h后熒光變弱，72 h仍可見陽性蛋白表達。DAPT處理24 h后，Notch2、Hes-1和MCP-1蛋白熒光均變弱，72 h仍可見少量的熒光。Western blot結果與免疫組織化學結果相似，但經DAPT處理72 h后，未見Notch2和Hes-1蛋白凝膠條帶。與相同時間Sham組大鼠比較，I/R組大鼠24、48和72h的Notch2、Hes-1和MCP-1蛋白表達上調，差異有統計學意義（P<0.01）。與相同時間I/R組比較，DAPT組大鼠腎組織24、48和72 h的Notch2、Hes-1、MCP-1蛋白和Caspase-1 2蛋白表達下調，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖2～7和表6。

圖2 兩組大鼠腎組織Notch2蛋白的表達 （免疫激光共聚焦法×400）

圖3 兩組大鼠腎組織Hes-1蛋白的表達 （免疫激光共聚焦法×400）

圖4 兩組大鼠腎組織MCP-1蛋白的表達 （免疫激光共聚焦法×400）

圖5 3組大鼠腎組織Notch2、Hes-1和MCP-1蛋白表達（Western blot）

圖6 3組大鼠腎組織中Hes-1蛋白的表達

圖7 3組大鼠腎組織MCP-1蛋白的表達

表6 兩組大鼠腎組織中Notch2蛋白表達的比較（n=5，±s）

表6 兩組大鼠腎組織中Notch2蛋白表達的比較（n=5，±s）

注：?與DAPT組比較，P<0.01

組別 24 h 48 h I/R組 0.59±0.06 0.49±0.06 DAPT組 0.42±0.06? 0.40±0.05?t值 4.786 4.679 P值 0.002 0.002

3 討論

Notch信號是一進化上高度保守的細胞間信號傳導通路，作用廣泛，可精確調節細胞的增生、分化、遷移、生長和死亡的過程，對個體的發育，尤其是三維結構器官的發育起決定性作用。其由一系列的蛋白分子家族組成，包括Notch受體、Notch配體、正負修飾分子以及轉錄因子[3-4]。Notch信號具有高度保守性，人和老鼠有4個Notch受體，即Notch1～4；Notch的配體在果蠅為Delta、Serrate，線蟲為Lag-2。因此Notch的配體又被稱為DSL蛋白[5]。Notch信號通路活化的關鍵是早老素依賴的γ-secretase（S3）裂開Notch受體的胞內段（notch intracellular domain，NICD），并釋放NICD轉位至細胞核，在細胞核與CSL蛋白相結合[5]。因此，筆者通過γ-secretase抑制劑DAPT阻斷Notch信號后，觀察下游轉錄分子的改變。

最近研究表明，Notch信號通路參與腫瘤的侵襲、轉移[6]，心肌細胞IRI[7]，以及肝纖維化過程[8]，而且通過影響核轉錄因子κB轉錄，調控TNF-α、IL-6、MCP-1等炎癥因子表達增多，參與類風濕關節炎滑膜炎癥的形成過程[9]。前期研究表明，腎IRI存在炎癥過程，腎小管上皮細胞可以轉化為炎癥細胞[1]。有研究表明，腎IRI可以誘發Notch2/Hes-1信號通路重新活化，參與腎小管的再生過程[10]。那么，Notch2/Hes-1信號通路是否參與腎IRI誘發的炎癥過程？

本研究結果顯示，腎I/R后，腎小管可見刷狀緣丟失、小管擴張、管腔內管型、間質炎癥細胞浸潤等腎小管壞死改變，腎小管間質半定量評分明顯高于Sham組，提示模型建立成功。而經DAPT處理后，腎小管病理改善，半定量評分降低，表明DAPT可能具有良好的腎保護作用。

進一步研究發現，正常的腎組織無Notch2蛋白表達，僅見少量的Hes-1蛋白表達，與既往的文獻報道一致[11]。然而IR誘導腎組織Notch2和Hes-1蛋白表達顯著增多，提示腎IRI時腎小管上皮細胞Notch2/Hes-1信號通路被重新激活。本研究結果還發現，Notch2和Hes-1蛋白表達的高峰時間與TNF-α、IL-6和MCP-1表達一致，于再灌注后24 h達高峰，提示Notch2/Hes-1信號通路的活化可能參與腎IRI時腎小管上皮細胞TNF-α、IL-6和MCP-1的轉錄。筆者進一步研究發現，DAPT選擇性地阻斷Notch信號活化后，TNF-α、IL-6和MCP-1表達顯著下調，表明活化的Notch2/Hes-1信號通路可能參與調控TNF-α、IL-6和MCP-1的轉錄。

目前，國內外尚未見Notch信號通路活化是否參與腎IRI相關炎癥的報道，但較多研究表明，Notch信號通路的活化參與多種炎癥病理過程，如KANG等[12]研究證實，Notch信號通路參與過敏性哮喘的炎癥病理過程，γ-secretase抑制劑可通過調節Th1和Th2細胞的反應，抑制NF-κB信號活化，從而減輕過敏性哮喘的炎癥反應。NAKAZAWA等[13-14]研究表明，類風濕關節炎滑膜細胞的Notch1信號表達增多，γ-secretase酶抑制劑可以抑制TNF-α 誘導的類風濕關節炎滑膜細胞增生，提示Notch信號通路可能參與類風濕關節炎的炎癥過程。FERNANDEZ等[15]研究發現，在TNF-α 刺激下，骨髓的微環境表達Notch受體及配體增多。因此，筆者推測Notch信號通路的活化可能參與腎IRI相關的炎癥過程。DAPT處理可降低血清BUN、Scr水平，改善腎小管間質損傷，提示DAPT具有良好的腎保護作用。進一步研究發現，DAPT可下調Notch2、Hes-1、TNF-α、IL-6、MCP-1的表達，提示DAPT的腎保護作用可能與一定程度地阻斷Notch2/Hes-1信號通路活化后，繼而抑制TNF-α、IL-6和MCP-1的轉錄，發揮抗炎作用有關。本研究從體內外證實Notch信號通路有望作為急性腎損傷治療的新靶點。

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