冷皂化—高效液相色譜法測定乳制品中葉黃素的5種順反式異構體

陳萬勤等

摘 要 建立了冷皂化高效液相色譜法測定乳制品中葉黃素的5種順反式異構體。將乳制品進行冷皂化處理后， 經正己烷石油醚二氯甲烷（2∶2∶1， V/V）提取， 使用YMC C30色譜柱分離， 以甲醇和甲基叔丁基醚為流動相進行梯度洗脫， 采用二極管陣列檢測器于445 nm波長下檢測， 外標法定量； 在0.127～5.082 mg/L范圍內的線性關系良好， 相關系數（R2）為0.9999， 回收率在96.7%～102.2%之間， RSD在4.1%～5.4%之間（n=6）， 檢出限為0.010 μg/g（S/N=3）， 定量限為0.030 μg/g（S/N=10）。 本方法簡單、準確、靈敏度高， 適用于乳制品中葉黃素5種異構體的檢測。

關鍵詞 高效液相色譜法； 葉黃素； 異構體； 乳制品

1 引 言

葉黃素（Lutein）， 又名黃體素， 是存在于蔬菜、花卉、水果與某些藻類生物中的天然類胡蘿卜素。葉黃素具有良好的預防人體衰老、動脈硬化[1]、抗氧化、抗癌功效[2]以及獨特的護眼功能[3，4]等， 在保健品、化妝品和動禽類飼料等多個領域廣泛應用。美國FDA于1995年批準了葉黃素作為食品補充劑用于食品中， 我國2007年批準了葉黃素作為營養強化劑添加到嬰幼兒或兒童配方食品中[5]。葉黃素分子結構中含多個共軛碳碳雙鍵結構， 由于烯鍵的存在， 葉黃素可以存在多種幾何異構體。葉黃素不同異構體在生物體內的生物活性也不同， 其中全反式構象的生物活性較順式構象要高很多[6，7]。目前市售的食品中很少有區分葉黃素不同異構體的含量。因此， 建立高效的葉黃素順反異構體的檢測方法具有重要的意義。

目前葉黃素的檢測方法主要以高效液相色譜法[8～10]和液質聯用法[11，12]為主。由于葉黃素在光和熱的作用下容易發生順反異構化[13，14]， 因此樣品的所有處理過程需在較低溫度和避光條件下進行， 避免全反式葉黃素發生異構化。所以到目前為止， 國際市場上也只有全反式葉黃素標準物質在售， 尚未有葉黃素順式異構體的標準物質， 對順式異構體進行定量仍然是一個難題。本研究采用全反式葉黃素作為標準物質， 對5種葉黃素異構體進行定量分析， 并且對樣品的前處理方法進行了研究， 采用冷皂化法進行樣品的前處理， 避免葉黃素在高溫皂化時葉黃素發生異構化， 采用液相色譜法結合YMC C30色譜柱對葉黃素異構體進行有效分離， 準確定量。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀， 配二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）； 紫外/可見分光光度計； 乙腈、甲醇（色譜純， Merk公司）； 甲基叔丁基醚、石油醚、二氯甲烷、正己烷、乙醇、四氫呋喃（色譜純， Tedia公司）； 2，6二叔丁基對甲苯酚（BHT， 純度99.4%， SigmaAldrich公司）； KOH（純度>80%， SigmaAldrich公司）； 實驗用水為MilliQ超純水。全反式葉黃素標準品（純度99.8%， ChromaDex公司）。

2.2 全反式葉黃素標準溶液的配制

準確稱取5.0 mg全反式葉黃素標準品于100.0 mL容量瓶中，用含0.003% BHT的乙醇溶解并定容。該溶液可在

40 ℃下完好保存6個月。準確吸取葉黃素標準儲備液用含0.003% BHT乙醇配制成標準系列溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ。采用分光光度法[15]和高效液相色譜峰面積歸一法校準標準系列溶液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ的濃度分別為5.082，2.033，1.016，0.254和0.127 mg/L。

2.3 色譜條件

液相色譜柱：YMC C30色譜柱（250 mm×4.6 mm， 3.5 μm， YMC公司）； 柱溫： 25 ℃； 進樣量：100 μL； 以甲醇（A）和甲基叔丁基醚（B）為流動相， 梯度洗脫： 0.0～14.0 min， 85%A， 15%B； 14.0～15.0 min， 90%A，10%B； 15.0～18.0 min， 10%A， 90%B； 18.0～22 min， 85%A， 15%B。 流速1.0 mL/min； 檢測波長： 445 nm， 參考波長： 550 nm。

2.4 樣品前處理

樣品的前處理過程都要在避光或者在經對紫外光過濾的燈光下進行， 以避免葉黃素發生異構化。稱取粉末樣品2 g（精確到0.001 g）或液態樣品10 g（精確到0.001 g）， 置于50.0 mL離心管中， （粉末樣品加入10 mL實驗室用水， 充分渦旋2 min）， 加入四氫呋喃5 mL， 渦旋混勻， 加入5% KOH甲醇溶液10 mL， 漩渦振蕩1 min， 于搖床上室溫振蕩反應30 min， 反應結束后加入含0.005%BHT的石油醚正己烷二氯甲烷（2∶2∶1， V/V）提取液10 mL， 加蓋漩渦混勻60 s， 6000 r/min離心10 min， 取上層有機相于玻璃試管中； 再用10 mL提取液重復提取一次， 合并有機相， 有機相在35 ℃下氮氣吹干， 用含0.003% BHT的乙醇溶液完全溶解， 并定容至5.0 mL， 用0.22 μm有機濾膜過濾， 供HPLC分析。

3 結果與討論

3.1 方法定量原理

葉黃素屬于類胡蘿卜素， 其分子式為C40H56O2， 分子量為568.9， 熱處理時， 全反式葉黃素異構化成為順式葉黃素異構體， 其中最常見的是13順式葉黃素、13′順式葉黃素和9順式葉黃素、9′順式葉黃素， 葉黃素也易被氧化及光誘導異構化， 因此， 實驗過程必須與氧氣和白光隔絕， 并且所有操作在室溫下進行， 全反式葉黃素的結構如圖1所示。

由于葉黃素容易發生異構化， 難以獲得順式葉黃素標準物質。有報道采用全反式葉黃素制備順式葉黃素標準物質的方法， 方法雖然可行， 但是不適用于檢測機構日常檢測工作。順式葉黃素與反式葉黃素在445 nm的吸光系數存在著差異， 在定量順式葉黃素異構體， 以反式葉黃素為標準， 使用修正系數0.7以修正順式和反式異構體吸收峰和消光系數之間的差異， 因此本實驗通過在445 nm下得到的順式葉黃素峰面積與全反式葉黃素標準品的峰面積相比， 從而實現對全反式葉黃素的定量分析， 也可以對4種順式葉黃素和全反式葉黃素同時進行計算， 最終計算總葉黃素含量。endprint

3.2 色譜條件的優化與葉黃素異構體的定性

C18色譜柱和C30色譜柱都可以用來檢測類胡蘿卜素， 但是C18色譜一般用于分析類胡蘿卜素的總量， 而C30色譜柱具有良好的峰形和較長的保留時間等優越的性能， 通常用于類胡蘿卜素的順反異構體的分離。

本研究參考了文獻[16]的方法對全反式葉黃素進行異構化反應。將1 mg反式葉黃素用少量甲苯溶解后， 加入2 mg/L碘正己烷溶液， 使碘的含量為葉黃素質量的2%， 將混合液放在40 W日光燈下光照1 h， 然后用1 mol/L硫代硫酸鈉溶液洗滌2次， 除去多余的碘， 有機相在30 ℃下氮氣吹干后， 用含0.003%BHT的乙醇溶液復溶， 定容至10.0 mL， 得到順式和反式葉黃素混合樣品， 用于葉黃素的定性分析。為了消除上一個色譜樣品雜質對下一個色譜樣品目標物的干擾， 在目標物完全洗脫后， 采用大比例的甲基叔丁基醚對色譜柱進行洗脫， 保證可能存在雜質完全被洗脫出來后不干擾下一個樣品的檢測。在液相色譜系統中， 對5種葉黃素異構體的紫外可見光譜圖進行全掃描， 葉黃素5種異構體的紫外可見光譜的吸收波長見表1， 9順式和13順式結構與全反式結構的葉黃素的最大吸收波長相差約4 nm， 這是由于順式結構葉黃素發生了紫移現象， 與文獻[8]報道一致。通過光譜對照并參照采用YMC C30色譜柱實現葉黃素5種順反異構體完全分離的文獻[8，17，18]， 對葉黃素5種異構體進行定性分析。全反式葉黃素標準樣品如圖2a所示， 經過異構化處理的葉黃素標準樣品中葉黃素5種順反異構體如圖2b所示， 各種葉黃素異構

體的分離效果良好。由于葉黃素標準對照品在運輸和轉移過程中， 不可避免會受光和熱影響， 全反式葉黃素會發生微量的異構化， 因此采用面積歸一化法得到全反式葉黃素的含量， 從而消除了微量順式葉黃素對計算結果的影響。

3.3 樣品制備方法的優化

葉黃素對光和熱都很敏感， 操作過程要避光且防止高溫， 因此實驗在常溫下對樣品進行皂化， 使用甲醇KOH溶液作為皂化液的皂化效果優于KOH水溶液， 減少了水溶液的稀釋作用， 同時甲醇作為有機溶劑加入， 有利于溶解葉黃素。為了防止提取過程中發生乳化， 促進葉黃素的溶解， 提高皂化效率， 在皂化過程加入四氫呋喃。

使用石油醚、正己烷、二氯甲烷作為提取溶劑， 發現3種試劑混合提取時效果較好； 考察了不同比例的混合溶液的提取效率發現， 當石油醚正己烷二氯甲烷（2∶2∶1， V/V）時， 提取效率高， 并且提取溶劑在提取液上層， 有利于提取操作， 減少了樣品基質的干擾作用。不同萃取溶劑的萃取效果見表2。本研究采用石油醚正己烷二氯甲烷（2∶2∶1， V/V）溶液作為提取液。

3.4 線性范圍、檢出限和定量限

對全反式葉黃素標準液進行檢測， 以儀器響應的峰面積A對全反式葉黃素的質量濃度C進行線性回歸， 在0.127～5.082 mg/L范圍內的線性關系良好， 回歸方程為A=1368.4C-9.7， 相關系數（R2）為0.9999。在空白樣品中添加葉黃素標準品， 以S/N=3確定方法的檢出限， 以S/N=10確定方法的定量限， 得到葉黃素的檢出限為0.010 μg/g， 定量限為0.030 μg/g。

3.5 回收率和精密度

對不含葉黃素乳粉樣品進行全反式葉黃素回收率實驗， 添加水平分別為0.200， 0.500和1.000 μg/g， 采用優化后的前處理方法對樣品進行處理， 每個添加水平重復6次， 平均回收率分別為97.5%， 102.2%和96.7%， RSD分別為5.4%， 4.3%和4.1%。

3.6 實際樣品測定

4 結 論

建立了乳制品中葉黃素5種順反異構體的高效液相色譜法。采用冷皂化前處理， 保證樣品在皂化過程中葉黃素能保持原有的構型， 使用YMC C30色譜柱對葉黃素5種順反異構體進行了有效分離， 4種順式異構體依據反式葉黃素標準物質進行準確定量分析。方法簡單快速， 準確度和精密度高， 適用于乳制品中葉黃素5種順反異構體的定量檢測。

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Abstract A cold saponification method for determination of 5 lutein stereoisomers in dairy products by high performance liquid chromatography （HPLC） was developed. Samples were coldsaponified at room temperature and extracted by nhexane/petroleum/dichloromethane （2∶2∶1， V/V/V）. Then 5 lutein stereoisomers were separated on a YMC C30 column with gradient elution using methanol/methyl tertbutyl ether as the mobile phase， and data were acquired by a photodiode array detector at wavelength of 445 nm. The calibration curve was linear in the range of 0.127-5.082 mg/L with correlation coefficient of 0.9999， and the recoveries were from 96.7% to 102.2% with the RSDs in the range of 4.1%-5.4% （n=6）. The limit of detection was 0.010 μg/g （S/N=3）， and the limit of quantification was 0.030 μg/g （S/N=10）. By presenting results of good accuracy， precision and sensitivity， this method validates its suitability for routine analysis of 5 lutein stereoisomers in dairy products.

Keywords High performance liquid chromatography； Lutein； Stereoisomers； Dairy products

（Received 20 October 2014； accepted 17 December 2014）endprint