白藜蘆醇對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠MMP—9及TIMP—1的影響

梅梅等

[摘要] 目的 探討白藜蘆醇對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠MMP-9及TIMP-1的影響。 方法 選擇健康7日齡新生Wistar大鼠 112只，分為三組：假手術組（n=36只）、缺氧組（n=38只）、HIBD+白藜蘆醇藥物干預組（n=38只），各組再分為6 h、24 h、48 h、72 h、5 d和7 d時間段進行檢測。比較各組不同時間點 MMP-9、TIMP-1的表達。 結果HIBD組的MMP-9水平治療6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分別顯著高于假手術組，但經RES干預后，HIBD+RES組的MMP-9水平分別顯著低于HIBD組（P<0.05），但仍顯著高于假手術組。 結論 RES能夠抑制MMP-9的表達，從而使伴隨MMP-9病理性表達升高的TIMP-1也相應減少，而調節MMP-9/TIMP-1的平衡，可能是其在HIBD中發揮神經保護作用的機制之一。

[關鍵詞] 缺氧缺血性腦損傷；新生大鼠；白藜蘆醇；MMP-9；TIMP-1

[中圖分類號] R722.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）09-0006-02

The impact of resveratrol on MMP-9 and TIMP-1 for hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats

MEI Mei1 WANG Xianhe1 SUN Huawei2

1.Department of Pediatric，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University， Jiamusi 154002，China； 2.Department of Radiotherapy，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China

[Abstract] Objective To investigate the impact of resveratrol on MMP-9 and TIMP-1 for hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats. Methods Selected healthy 7 day old newborn Wistar rats 112 rats，were divided into three groups： sham operation group （n=36）， hypoxia group （n=38 only）， HIBD+resveratrol drug intervention group （n=38）， each group was tested at 6 h， 24 h， 48 h， 72 h， 5 d and 7 d. The expression of TIMP-1 and MMP-9 Groups were compared at different time points. Results The MMP-9 level of 6 h， 24 h， 48 h，72 h， 5 d， 7 d in HIBD group， were significantly higher than those in the sham operation group，and was significantly higher than that of RES， but the MMP-9 levels in intervention group HIBD+RES were significantly lower than those in HIBD group（P<0.05）， but still significantly higher than those in the shamoperation group. Conclusion The expression of RES can inhibit MMP-9， so with MMP-9 diseaseand rational expression of elevated TIMP-1 also reduce， and regulate the balance of MMP-9/TIMP-1， may be the one of the nerve protection mechanism in HIBD.

[Key words] Hypoxic ischemic brain damage； Neonatal rat； Resveratrol； MMP-9； TIMP-1

新生兒缺氧缺血性腦損傷（HIBD）是導致小兒智能低下和腦性癱瘓的重要原因。腦水腫是其最常見的病理改變，包括早期細胞毒性水腫和血腦屏障（BBB）損傷引起的血管源性腦水腫（VBE）。近年來研究證實，基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）與急性期BBB的損傷密切相關，進而導致VBE的形成，而MMP-9的活性又受其金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP-1）的特異性抑制[1]。近年來研究發現，通過藥物抑制MMP-9在HIBD中的表達以減輕腦水腫，可能為治療缺氧缺血性腦病拓展新思路。白藜蘆醇（resveratrol，RES）是來源于植物中的一種脂溶性天然植物抗毒素，研究證實，其具有抗血小板聚集、抗炎、清除自由基、抗癌、抗氧化、心血管保護等作用[2，3]。本研究旨在探討白藜蘆醇對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠MMP-9及TIMP-1的影響，從而為中樞神經系統的保護機制研究提供進一步的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

健康7日齡新生Wistar大鼠 112只，購于佳木斯大學實驗動物中心。納入標準：精神活潑，反應靈敏，體形正常。排除標準：未達到上述年齡標準；精神萎靡，反應遲鈍；有感染及其他不健康癥狀；行走不穩。將112只Wistar大鼠分為三組：假手術組（n=36只）：手術分離頸總動脈后不結扎，縫合手術切口后，不放入氧倉做低氧處理；缺氧組（n=38只）：單純做缺氧缺血性腦病（HIBD）模型；HIBD+白藜蘆醇藥物干預組（n=38只）：HIBD模型制作后每天腹腔注射2%的RES藥液，按50 μg/g，1次/d。各組分為6 h、24 h、48 h、72 h、5 d和7 d 個時間段進行檢測。

1.2方法

1.2.1 建立HIE動物模型 取新生7日齡Wistar大鼠。取頸正中1 cm左右縱形切口，在左側胸鎖乳突肌深面與氣管之間找到并游離左側頸總動脈，暴露左頸總動脈，用5-0號絲線結扎雙線結扎后剪斷左側頸總動脈。以（1～2）L/min的速度，持續輸入含8%氧氣和92%氮氣的混合氣體，以CY-12C測氧儀監控氧濃度為（8±0.5）%，低氧2 h后將新生鼠取出，返回母鼠身邊繼續喂哺以備用。同時假手術組（僅做頸正中切口，游離左側頸總動脈，但不結扎）亦不做低氧處理。

1.2.2 藥物配制及干預治療 無菌操作下先用醫用酒精溶解RES，再用生理鹽水稀釋濃度為2%的溶液，-20℃冰箱保存。造模成功后藥物干預組乳鼠按50 μg/g，腹腔注射給藥，1次/d。缺氧組乳鼠則同時給予上述標準等量生理鹽水腹腔注射。至各不同時間點處死取材。

1.2.3 取材及切片的制作 三組大鼠分別于缺氧缺血后6 h、12 h、24 h、72 h、5 d和7 d處死。斷頭取腦，以視交叉為切點，冠狀位向后取一片約厚3 mm組織。標本按常規給予甲醛固定。用石蠟切片機做連續冠狀切片，置于經多聚-L-賴氨酸處理的防脫載玻片上，片厚5 μm。

1.2.4 免疫組織化學染色檢測MMP-9、TIMP-1的表達 選用SP即用型免疫組化試劑盒進行免疫染色，DAB顯色。所有步驟參照試劑盒說明書進行。設置對照：取相同量的PBS代替一抗MMP-9和TIMP-l，其余步驟同前。

1.3 陽性細胞的判斷[4]

MMP-9、TIMP-1陽性著色表現為胞漿染成淺黃色棕黃色或棕褐色。采用陽性細胞計數法，每張切片在400倍物鏡下分別隨機選取不重復的6個視野，計數MMP-9、TIMP-1陽性細胞數，取平均值，以均數±標準差表示。

1.4 統計學處理

應用SPSS12.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較使用t檢驗或進行方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

見表1、2。HIBD組的MMP-9水平、TIMP-1水平治療6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分別顯著高于假手術組，但經RES干預后，HIBD+RES組的MMP-9水平顯著低于HIBD組（P<0.05），但仍顯著高于假手術組。

3討論

MMPs是降解ECM、同時又是阻止ECM對血管內皮細胞修復作用的主要蛋白酶，參與胚胎正常發育及組織重塑，并在多種病理過程中發揮作用[5]。近研究表明，腦缺氧缺血后出現MMP-9的合成上調，MMP-9與BBB的破壞、繼發性炎性反應和VBE等密切相關[6]。研究顯示[7]在局灶性腦缺血再灌注小白鼠模型實驗中發現，活化的MMP-9的早期出現導致BBB破壞和VBE。而MMPs的表達可經多種機制調控發生：轉錄水平、酶原激活水平和TIMPs的調節。

TIMP-1由巨嗜細胞、角質生產細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞和內皮細胞合成，能抑制絕大多數MMPs，己經證實TIMP-1優先與MMP-9特異性結合，形成可溶性非共價復合物而發揮其抑制作用[8]。且研究發現，TIMPs不僅是MMPs的抑制劑，可能還在MMPs的激活級聯過程中扮演重要角色[9]。

國內對于MMP-9、TIMP-1在參與缺血性腦血管病變后BBB損害、VBE的形成過程中的變化規律及相互關系研究甚少；對于MMP-9在腦缺血再灌注損傷過程中其非特異性抑制劑干預方面的研究文獻也很少見。

RES是一種發現于多種食用植物和紅葡萄酒的天然化合物，具有抗氧化活性、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、抗炎、雌激素樣活性、生長抑制活性、免疫調節以及化學預防作用、誘導細胞凋亡及抗腫瘤活性等[10]。近年針對RES神經保護性作用的研究也成為近年來神經科學領域里的一個研究熱點。本實驗結果顯示，HIBD組的MMP-9水平治療6 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d分別顯著高于假手術組，但經RES干預后，HIBD+RES組的MMP-9水平分別顯著低于HIBD組（P<0.05），但仍顯著高于假手術組，證實RES不但可抑制MMP-9的表達，并使與其伴隨升高的TIMP-1的表達也相應減少，尤其是在VBE發生的高峰時期24～48 h間，RES可明顯減少MMP-9的表達，從而降低了TIMP-1的病理性表達增強的反應，而調節MMP-9/TIMP-1的平衡，從而減輕腦水腫發揮腦保護的作用[11]。

綜上，我們得出，RES能夠抑制MMP-9的表達，從而使伴隨MMP-9病理性表達升高的TIMP-1也相應減少，而調節MMP-9/TIMP-1的平衡，可能是其在HIBD中發揮神經保護作用的機制之一。

[參考文獻]

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[11] Yushchenko M，Mader M，Elitok E，et al. Interferon-beta-1b decreased matrix metalloproteinase-9 serum levels in primary progressive multiple sclerosis[J]. J Neurol，2003，250（10）：1224-1228.

（收稿日期：2015-02-02）