益腎養(yǎng)陰合劑對MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的保護作用及部分機制研究*

吳 洋，張巍瓊，李東云，粟 榮，

(1.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021；2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

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·實驗研究·

益腎養(yǎng)陰合劑對MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的保護作用及部分機制研究*

吳 洋1，張巍瓊2，李東云2，粟 榮1，

(1.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021；2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

目的 探討益腎養(yǎng)陰合劑對腎功、腎臟病理變化及對P-STAT3表達的影響，揭示其發(fā)揮療效的作用機制，為益腎養(yǎng)陰合劑治療狼瘡性腎炎(LN)提供理論依據(jù)。方法 兩種種系相同不同品種的50只小鼠隨機分5組：正常組C57BL/6J小鼠(0.9%生理鹽水)；MRL/1pr小鼠根據(jù)尿蛋白含量隨機分為4組：模型組、中藥組、中藥聯(lián)合激素組、激素組，連續(xù)給藥4周后觀察P-STAT3、尿蛋白含量、血肌酐、尿素氮及腎臟病理變化。結(jié)果 在給藥第一周，與模型組相比，尿蛋白含量在各治療組之間無明顯差異(P>0.05)。在第2、3、4周時，與模型組相比，各治療組的尿蛋白、血肌酐、尿素氮含量均有顯著下降(P<0.05)，中藥聯(lián)合激素組的尿蛋白含量最低(P<0.05)。給藥處理后，p-stat3的表達均呈下降趨勢，中藥組、激素組的p-stat3表達相比模型組有所減少(P<0.05)；中藥聯(lián)合激素組的降低情況最為顯著(P<0.05)。HE染色三個治療組腎組織局部輕度系膜細胞增生，腎小球炎癥細胞浸潤減少。結(jié)論 1.益腎養(yǎng)陰合劑能改善MRL/lpr小鼠的腎功能及腎臟病理，且聯(lián)合激素腎功能改善更明顯。2.下調(diào)磷酸化的STAT3的表達可能是益腎養(yǎng)陰合劑治療狼瘡性腎炎的作用靶點之一。

益腎養(yǎng)陰合劑；狼瘡性腎炎；MRL/lpr小鼠；P-STAT3；病理

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一種累及多系統(tǒng)、多器官的具有多種自身抗體的免疫性疾病。SLE累及腎臟時稱為狼瘡性腎炎(Lupus Nephritis，LN)，是SLE最為常見和嚴(yán)重的表現(xiàn)，也是影響疾病預(yù)后和導(dǎo)致患者死亡的主要原因。SLE患者腎活檢顯示，腎臟受累者幾乎為100%，其中有臨床腎損害表現(xiàn)者，占45%～85%[1]。益腎養(yǎng)陰合劑是根據(jù)云南省中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕科常見病種優(yōu)化診療方案制定的協(xié)定方藥，在臨床上運用多年，具有良好的療效。本課題旨在觀察益腎養(yǎng)陰合劑對MRL/lpr小鼠尿蛋白、血肌酐、尿素氮的影響及腎臟的病理變化，從組織、分子生物水平闡述益腎養(yǎng)陰合劑對腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 C57BL/6背景小鼠為正常組，MRL/lpr小鼠測量體重和尿蛋白以選取實驗組小鼠：體重(29±3)g，尿蛋白(110±5)mg/mL。隨機分為4組，分別為：模型組(給予0.9%生理鹽水)；中藥組(益腎養(yǎng)陰合劑)；中藥聯(lián)合激素組(益腎養(yǎng)陰合劑+醋酸潑尼松)；激素組(醋酸潑尼松)。

1.2 實驗藥物 益腎養(yǎng)陰合劑由云南省中醫(yī)醫(yī)院煎藥房統(tǒng)一煎煮。醋酸潑尼松片(重慶科瑞制藥(集團)有限公司，批號：H50020459)。

1.3 指標(biāo)檢測及方法 用BCA蛋白測定盒檢測尿蛋白含量；比色法檢測 血肌酐、尿素氮測定；Western blot檢驗P-STAT3測定；HE染色觀察腎臟病理變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用t檢驗，或單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組尿蛋白比較 見表1。

表1 各時間點各組小鼠的尿蛋白檢測結(jié)果

注：同一時間段不同組之間比較：△表示與正常組相比P<0.05；▽表示與模型組相比P<0.05；*表示與中藥組相比P<0.05；○表示與中藥聯(lián)合激素組相比P<0.05；●表示與激素組相比P<0.05

由表1及圖1可知：同一時間點，各組尿蛋白檢測情況，在給藥第一周后，與模型組相比，MRL/lpr小鼠的尿蛋白含量在各治療組之間無明顯差異(P>0.05)。在給藥第2周時，與模型組相比，各治療組的MRL/lpr小鼠尿蛋白含量均有顯著下降(P<0.05)，差異有顯著性意義。在給藥第3周時，與模型組相比，MRL/lpr小鼠各治療組的尿蛋白含量均有顯著降低(P<0.05)，差異有顯著性意義，但在中藥組、中藥聯(lián)合激素組以及激素組這三組間的尿蛋白含量無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在給藥第4周時，與模型組相比，各治療組的尿蛋白含量均有顯著降低(P<0.05)，其中中藥聯(lián)合激素組的尿蛋白含量降低最為顯著(與中藥組，p=0.000，P<0.05；與激素組，p=0.001，P<0.05)，而中藥組與激素組的尿蛋白含量相比無統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.265，P>0.05)。

圖1 同時間點下不同組小鼠的尿蛋白檢測情況

(NS.表示生理鹽水；Trad.表示中藥益腎養(yǎng)陰合劑；com.表示中藥聯(lián)合激素；PA.表示激素醋酸潑尼松；w.表示week，周)

2.2 各組腎功能指標(biāo)及P-STAT3的結(jié)果 見表2。

表2 給藥4周后，各組小鼠血清中血肌酐、尿素氮含量測定結(jié)果

注：△表示與正常組相比P<0.05；▽表示與模型組相比P<0.05；*表示與中藥組相比P<0.05；○表示與中藥聯(lián)合激素組相比P<0.05；●表示與激素組相比P<0.05

圖2 western blot法測定各組小鼠腎臟組織中p-STAT3表達情況結(jié)果圖

從表2可知：中藥聯(lián)合激素組的血Scr值下降最明顯(與中藥組，P<0.05；與激素組，P<0.05)。而中藥組和激素組的血肌酐含量無顯著差異(p=0.791，P>0.05)。各治療組的小鼠尿液中尿素氮含量均有顯著下降(P<0.05)，其中中藥聯(lián)合激素組的尿素氮含量降低最為明顯，另外，給藥4周后，中藥組的尿素氮含量比激素組更少(P<0.05)。

從表2和圖2可得知：在正常組小鼠腎臟組織中p-stat3蛋白的表達非常弱，而MRL/lpr小鼠腎臟組織中p-stat3表達增強(P<0.05)；經(jīng)給藥處理后，p-stat3的表達均呈下降趨勢，中藥組的p-stat3表達相比模型組有所減少(P<0.05)；中藥聯(lián)合激素組的降低情況最為顯著(與中藥組，P<0.05；與激素組，P<0.05)，而激素組的p-stat3表達比中藥組的高(p=0.038，P<0.05)。

2.3 腎臟病理切片HE染色結(jié)果 光鏡下觀察到正常組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)完整，無增生和炎癥細胞浸潤；MRL/lpr小鼠模型組腎組織中系膜細胞、內(nèi)皮細胞呈輕中度增生，伴有炎癥細胞浸潤，部分腎小球體積增大，腎間質(zhì)有單核細胞浸潤，而三個給藥組腎臟病變均較對照組有所減輕，局部輕度系膜細胞增生，腎小球炎癥細胞浸潤減少。(見圖3)

圖3 MRL/lpr小鼠腎組織病理切片HE染色×200

(注：A：正常組，B：模型組，C：中藥組，D：中藥聯(lián)合激素組，E：激素組)

3 討論

狼瘡性腎炎當(dāng)屬“陰陽毒、紅蝴蝶斑、日曬瘡、腎痹、陽毒發(fā)斑”等范疇。孟如教授認為狼瘡性腎炎的病因多與感受邪毒有關(guān)，熱毒為關(guān)鍵，熱毒傷陰而致陰虛火旺。在本病發(fā)展過程中多由肺、脾、腎三臟功能失調(diào)而內(nèi)生瘀血、痰濁、濕熱、水濕等病理產(chǎn)物。瘀血始終貫穿狼瘡性腎炎的不同階段，在緩解期，熱毒已去，陰虛或氣陰兩虛為病機的主要方面[2]。益腎養(yǎng)陰合劑是根據(jù)本院風(fēng)濕科常見病種優(yōu)化診療方案制定的協(xié)定方藥，該方由黃芪生脈六味二至丸加減化裁而成，具有益氣固腎，養(yǎng)陰清熱之功效。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種綜合征，每個患者誘發(fā)疾病的因素和免疫系統(tǒng)缺陷都不盡相同。JAK-STAT信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡、血管生成以及免疫調(diào)節(jié)等過程。近年研究發(fā)現(xiàn)[3]，JAK/STAT 通路與多種腎臟疾病中的足細胞、系膜細胞、腎小球血管內(nèi)皮細胞、腎小管上皮細胞及間質(zhì)炎癥相關(guān)細胞的病理改變密切相關(guān)。JAK-STAT信號通路在細胞因子的傳導(dǎo)過程中起重要的作用，調(diào)節(jié)機體的免疫功能及介導(dǎo)炎性反應(yīng)等作用[4]。JAK / STAT 通路與炎癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，不僅可以控制自身下游炎癥相關(guān)基因的表達，還可以與其他多種炎癥信號通路[核因子 κB(NF-κB)和轉(zhuǎn)化生長因子 β(TGF-β)等通路]發(fā)生相互作用，在機體炎癥反應(yīng)過程中起著極為重要的調(diào)節(jié)作用。最近研究發(fā)現(xiàn)[5]，TGF-β1在狼瘡性腎炎發(fā)病中起著免疫調(diào)節(jié)作用，P-STAT3表達減少，能抑制TGF-β1等細胞因子過度生成。P-STAT3是JAK-STAT信號通路的下游，STATs 家族能和DNA結(jié)合，且可和JAK等酪氨酸磷酸化信號通路偶聯(lián)，把細胞外信號與細胞基因表達調(diào)控結(jié)合起來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Harada等[6]發(fā)現(xiàn)SLE患者T細胞中磷酸化STAT3的表達比正常對照明顯升高，減少STAT3能使SLET細胞向炎癥組織遷移。本實驗研究發(fā)現(xiàn)MRL/lpr小鼠腎臟組織中p-stat3表達增強，給藥處理后，p-stat3的表達均呈下降趨勢，中藥組、激素組的p-stat3表達相比模型組有所減少(P<0.05)；中藥聯(lián)合激素組的降低情況最為顯著(P<0.05)。三治療組均能降低血肌酐、尿素氮、尿蛋白含量，中藥聯(lián)合激素組優(yōu)于其他2組(P<0.05)，給藥4周后，中藥組的尿素氮含量比激素組更少(P<0.05)，說明在降低尿素氮方面，中藥組的效果優(yōu)于激素組。此外腎組織的HE染色發(fā)現(xiàn)，治療組的腎小球損傷較模型組減輕。綜上可知益腎養(yǎng)陰合劑能一定程度上起到保護腎臟的作用，中藥聯(lián)合激素對MRL/lpr小鼠腎臟保護作用更明顯。

本課題研究，證實益腎養(yǎng)陰合劑能抑制P-STAT3增加，并改善腎功能，對狼瘡性腎炎具有一定的治療作用，體現(xiàn)了中醫(yī)藥保護腎臟的藥理效應(yīng)及其治療狼瘡性腎炎的較好療效，充分發(fā)展中醫(yī)藥的優(yōu)勢，為治療狼瘡性腎炎提供新思路。

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Study on the Protective Effect and Mechanism ofYishenYangyinMixtureon Lupus Nephritis of MRL/lpr Mice

WU Yang1， ZHANG Wei-qiong2, LI Dong-yun2, SU Rong1

(1.YunnanProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Kunming650021,Yunnan；2.YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650500,Yunnan)

Objective: To study the effect ofYishenYangyinMixtureon renal function, renal pathological changes and P-STAT3 presentation and reveal its clinical mechanism in order to provide a theoretical basis for the treatment of lupus nephritis (LN). Methods: Two germ lines of different kinds of 50 mice were randomly divided into five groups. Normal C57BL/6J mice (0.9% saline) and MRL/1pr mice were randomly divided into four groups according to urinary protein content, a model group, a TCM group, a TCM combined hormone group and a hormone group and were administrated for 4 weeks to observe their P-STAT3, urine protein, serum creatinine, blood urea nitrogen and renal pathological changes. Results: In the 1st week administration, compared with the model group, the urine protein of each group was no significant difference (P>0.05). In the 2nd, 3rd and 4th week administration, compared with the model group, the urine protein, serum creatinine and urea nitrogen of each group significantly decreased (P<0.05), among which the urine protein of the TCM combined hormone group was lowest (P<0.05). After the administration, p-stat3 presentation showed a downward trend. The p-stat3 presentation of the TCM group and the hormone group decreased when compared with that of the model group (P<0.05). The p-stat3 of the TCM combined hormone group decreased most significantly (P< 0.05). HE staining of renal tissue of three treatment groups showed local mild mesangial cell proliferation and glomerular inflammatory cell infiltration reduction. Conclusions: A.YishenYangyinMixturecan improve the renal function and renal pathology of MRL/lpr mice, and improve more obviously when combined hormone. B. The reduced phosphorylation STAT3 may be one of the targets for the treatment of lupus nephritis.

YishenYangyinMixture, lupus nephritis, MRL/lpr mice, P-STAT3, pathology

國家中醫(yī)藥管理局十一五中醫(yī)痹病學(xué)重點學(xué)科。< class="content">作者簡介：吳洋(1962-)，女，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：主要從事中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕病的防治研究。
E-mail：451886900@qq.com

吳洋(1962-)，女，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：主要從事中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕病的防治研究。 E-mail：451886900@qq.com

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1007-2349(2015)09-0046-03

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