去除U(VI)的微生物組合構建及培養條件的優化

劉小玲，陳曉明* ，阮 晨，廖祥兵

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010;2.西南科技大學核廢物與環境安全國防重點學科實驗室，四川綿陽 621010)

近年來，隨著鈾礦開采和核工業技術的發展，鈾及其化合物得到廣泛應用，但產生的含鈾廢物對周圍水體及環境造成的污染也越來越嚴重，且伴隨著其他放射性核素和金屬污染如 U235、Pu238、Cr、Mn、Fe 等。其中，鈾是一種對人體有放射性的核素，主要累積在肝臟、腎和骨骼，造成細胞的分化、凋亡等［1］。相對物理與化學修復技術，生物修復方法因具有顯著的優勢而得到大量研究者的關注。目前，人們已發現枯草芽孢桿菌、硫酸鹽還原菌、檸檬酸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、耐輻射奇球菌等多種微生物對重金屬(核素)有去除作用［2－6］。楊晶等［7］指出，微生物與鈾作用的機理包括表面配合、氧化還原、無機微沉淀、離子交換等機理。但是，部分微生物對Cd、Hg、Ag等金屬非常敏感，甚至受到重金屬(核素)的毒害作用［8］。

隨著環境條件的改變，微生物的生長可引起自身形態、生長、繁殖等特征的改變，從而適應周圍環境的變化，但是當某些條件的改變超過微生物的極限時，也可引起微生物的死亡。據報道，微生物對重金屬(核素)的去除效應易受到pH、溫度、金屬離子濃度、作用時間、接種量等多種因素的影響［9］。因此，篩選U(VI)的抗性微生物及微生物組合，優化微生物組合的培養條件，研究其對U(VI)的去除效應，對促進微生物在環境治理中具有重要意義。

筆者以鈾尾礦與鹽堿地等特殊環境中篩選的優勢菌株、文獻中具有特殊功能的菌株等為研究材料，篩選能耐受U(VI)的優勢微生物和微生物組合，并且進一步探究在培養條件下微生物及微生物組合對U(VI)的去除效率，通過正交試驗考察微生物組合去除U(VI)的最適pH、溫度、U(VI)初始濃度。

1 材料與方法

1.1 微生物菌株 XJ1(Bacillus subtilis)，芽孢桿菌屬，新疆鹽堿地分離的優勢菌株;考式玫瑰菌(Kocuria rosea)，考克式菌屬，若爾蓋鈾礦分離的優勢菌株;耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans)，奇球菌屬，來源于中國微生物菌種保藏中心;檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，檸檬酸桿菌屬，來源于中國微生物菌種保藏中心。

1.2 微生物培養基 為了消除微生物培養基對U(VI)測量的影響，選擇相對于其他微生物培養基含有機成分較少的胰蛋白胨酵母葡萄糖培養基(TGY)。其主要成分為胰蛋白胨5.0 g、酵母粉 3.0 g、葡萄糖 1.0 g，定容至 1 000 ml，pH 7.0～7.2。

1.3 培養條件下微生物對U(VI)的抗性與去除能力研究 在100 ml作用體系中，U(VI)初始濃度分別為10、30、50 mg/L，置于120 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養60 h。用分光光度計在600 nm處測量細胞懸浮液OD值。每隔12 h取樣，8 000 r/min振蕩5 min，利用偶氮胂(Ⅲ)分光光度法在652 nm處測量上清液中U(VI)濃度。重復3次。微生物對U(VI)的去除率按下式計算:

式中，C1為U(VI)初始濃度;C2為U(VI)殘留質量濃度。

1.4 去除U(VI)的微生物組合篩選 將檸檬酸桿菌、耐輻射奇球菌按1∶1比例形成微生物組合，按10%接種量加入TGY培養基中，使得U(VI)初始濃度為30 mg/L，置于轉速為120 r/min、溫度為30℃的恒溫振蕩培養箱中培養36 h，分析單菌株與組合菌對U(VI)的耐受性。

1.5 去除U(VI)的微生物組合培養條件優化 按接種量10%，檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合與U(VI)作用36 h，以U(VI)去除率為指標，考察菌株組合去除U(VI)的pH、溫度、U(VI)初始濃度。對pH、溫度、U(VI)初始濃度3個相互影響因素按L9(34)進行正交試驗(表1)。每組試驗3個平行樣。

表1 試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 U(VI)對微生物生長的影響 為了探索微生物對U(VI)的去除效應，首先需要研究U(VI)對細菌的生長影響情況，使錐形瓶中的 U(VI)保持在10、30、50 mg/L，30 ℃，120 r/min振蕩培養60 h，每隔12 h取樣，于600 nm處測定培養物中的細菌濃度，分別考察微生物在TGY培養基中的生長情況和對不同濃度U(VI)的耐受性。

由圖1可知，在U(VI)的脅迫下，菌株OD600均出現明顯變化，除考式玫瑰菌外，其他3種微生物均能耐受50 mg/L U(VI)。研究表明，高濃度U(VI)對檸檬酸桿菌的生長有輕微的抑制作用，但與10 mg/L U(VI)作用時明顯促進該菌株的生長。檸檬酸桿菌分泌的檸檬酸可能改變原溶液中的pH，刺激該菌株的生長。總的說來，檸檬酸桿菌生長受不同濃度U(VI)的影響較小。

U(VI)對耐輻射奇球菌對數生長期具有較小的影響，但在對數期和穩定期影響不明顯。陳立等［10］指出，耐輻射奇球菌對核素的抗性機制歸因于DNA損傷的高效修復能力、對活性氧自由基的有效清除能力、自身特殊的基因結構與生存方式3個方面。考式玫瑰菌OD600均低于對照組，在未加入U(VI)的情況下，培養至36h，其OD600可達到5.97，其生長雖可達到5.04左右，但生物量明顯降低。這說明從鈾污染區域分離的微生物相對于其他微生物具有明顯的生長優勢。這可能與它的生存環境相關。

2.2 微生物對U(VI)的去除能力研究 在250 ml錐形瓶中，加入87 ml TGY培養基與10 ml OD值為0.8的XJ1、考式玫瑰菌、耐輻射奇球菌、檸檬酸桿菌菌液，30 mg/L U(VI)，培養溫度30℃，120 r/min振蕩培養箱中培養36 h。每隔12 h取樣，8 000 r/min振蕩5 min，利用偶氮胂(Ⅲ)分光光度法在652 nm處測量上清液中U(VI)的濃度。每組試驗重復3次。

由圖2所知，耐輻射奇球菌、檸檬酸桿菌對U(VI)有顯著的去除效應，對 U(VI)的去除率分別達到80.4%、84.8%，而XJ1、考式玫瑰菌對 U(VI)的去除率僅分別為47.6%、35.7%。

檸檬酸桿菌為兼性厭氧菌，直桿狀，表面光滑，無莢膜，直徑約為1.0 μm，革蘭氏陰性菌。Xie等［11］研究表明，檸檬酸桿菌對U(VI)的吸附量可達9 000 mg/g，但研究中當U(VI)濃度為30 mg/L時檸檬酸桿菌對U(VI)的去除率可達84.8%。由此可知，檸檬酸桿菌適合處理低濃度含鈾廢水［12］。

耐輻射奇球菌為兼性厭氧菌，球狀，能產生粉紅色色素，革蘭氏陽性菌，具有四分體結構。研究中，耐輻射奇球菌對30 mg/L U(VI)的去除率可達到80.4%。與鄧欽文等［6］運用耐輻射奇球菌菌體在優化條件下對50 mg/L U(VI)的去除率達92.3%相比，去除率稍低，可能是利用活體微生物去除U(VI)的緣故。相關報道也指出，一些重金屬抗性基因已在耐輻射奇球菌中表達［13－16］。

2.3 單菌株與混合菌株對U(VI)的耐受性比較 將篩選得到的兩種優勢菌株按1∶1比例建立對U(VI)作用的高效組合，設定檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合，考察單菌株與混合菌株對對U(VI)的耐受性。

由圖3可知，檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合對30 mg/L U(VI)的抗性明顯增加，其生長趨勢相對于兩單菌株均有增強，說明它為有效組合。由此可知，菌株的生長與U(VI)的去除率保持某種線性關系。因此，推測檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合能提升U(VI)的去除效果。

2.4 去除U(VI)的檸檬酸桿菌-耐輻射奇球菌的正交試驗結果分析 影響微生物生長和去除U(VI)的因素較多。試驗中，著重考察pH、溫度、U(VI)初始濃度對去除U(VI)的影響。

由表2可知，檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合去除U(VI)的最佳條件為:pH 6.0、溫度30℃、U(VI)初始濃度10 mg/L。各因素對檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌去除U(VI)的影響順序為pH＞溫度＞U(VI)初始濃度。pH相對于溫度和U(VI)初始濃度對微生物組合去除U(VI)的影響較大。

表2 檸檬酸桿菌-耐輻射奇球菌的正交試驗結果

對比微生物組合對U(VI)的去除率，溫度較之于U(VI)初始濃度對微生物組合去除U(VI)的影響較大。正交試驗中，溫度30℃為去除U(VI)的最適溫度，推測溫度可能影響細胞上金屬吸附位點和增加吸附位點與金屬離子的親和力，或為金屬離子在細胞內主動運輸提供能量而提升去除效率［17］。U(VI)初始濃度對組合菌去除U(VI)的影響較小。這可能是由于試驗中U(VI)濃度較小。

3 結論

在U(VI)的脅迫下，篩選出3種耐受U(VI)的微生物，分別是XJ1、耐輻射奇球菌、檸檬酸桿菌，且均能耐受50 mg/L U(VI)。研究表明，耐輻射奇球菌與檸檬酸桿菌對U(VI)有顯著的去除能力，去除率分別達到80.4%、84.8%，而其他2種微生物則對U(VI)的去除能力不強。

運用單菌株和菌株組合的耐受性比較分析，構建了檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合，再通過三因素三水平優化檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌去除U(VI)的pH、溫度、U(VI)初始濃度。結果表明，在最佳條件(pH 6.0、溫度30℃、U(VI)初始濃度10 mg/L)下，檸檬酸桿菌－耐輻射奇球菌組合對U(VI)的去除率可達到98.3%。

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