呋喃它酮代謝物直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法的建立

呂月霞，王 瑞，黃登宇，*，王云貴，李 濤

（1.山西大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，廣州深圳518101；3.山西先鋒科技開發(fā)有限公司，山西太原030006）

呋喃它酮代謝物直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法的建立

呂月霞1，王 瑞1，黃登宇1，*，王云貴2，李 濤3

（1.山西大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.深圳易瑞生物技術(shù)有限公司，廣州深圳518101；3.山西先鋒科技開發(fā)有限公司，山西太原030006）

采用以對(duì)碘苯酚為增強(qiáng)劑的魯米諾-辣根過氧化物酶-過氧化氫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)體系，建立檢測(cè)動(dòng)物組織中呋喃它酮代謝物5-嗎啉甲基-2-氨基-2-僫唑烷基酮（AMOZ）殘留的直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法（dc-CLEIA）。結(jié)果表明：此方法IC50為0.62 ng/mL，檢測(cè)限為15.52 pg/mL，線性范圍0.038～9.78 ng/mL，變異系數(shù)均小于10%；該方法中抗體除了與呋喃它酮原藥有一定交叉外，與其他結(jié)構(gòu)類似物無交叉，表現(xiàn)了良好的特異性；雞肉樣品添加回收率為83%～94%，驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性，為實(shí)際動(dòng)物組織中AMOZ殘留提供了便捷、準(zhǔn)確、快速篩查的手段。

呋喃它酮代謝物，直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法，雞肉

獸藥殘留是影響食品安全問題最主要也是最嚴(yán)重的因素之一[1]。硝基呋喃類藥物對(duì)革蘭氏陰性和陽性菌都有抗菌作用，破壞細(xì)菌體內(nèi)氧化還原酶使細(xì)菌正常代謝紊亂，起到很好的殺菌作用[2-4]。呋喃它酮主要用來治療動(dòng)物腸道感染疾病，也可作為促進(jìn)生長(zhǎng)的添加劑，呋喃它酮及其代謝物能夠誘導(dǎo)機(jī)體基因突變，且能誘發(fā)癌癥[5]。歐盟1995年規(guī)定動(dòng)物性食品中禁止使用硝基呋喃類藥物[6]，美國(guó)FDA 2002年公布的進(jìn)口動(dòng)物性食品中禁用11種藥物清單中就包括呋喃西林和呋喃唑酮[7]，我國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年在235號(hào)文件《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定呋喃它酮和呋喃唑酮在所有可食性動(dòng)物組織中都不得檢出[8]。硝基呋喃類藥物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)很快分解和代謝，其代謝物可與蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定且長(zhǎng)期存在的結(jié)合物，燒烤、微波加熱和蒸煮等方式無法有效降解，人們食用后在胃酸作用下經(jīng)過水解，使其代謝物與蛋白質(zhì)分離，從而對(duì)人體產(chǎn)生危害，故檢測(cè)其代謝物更有意義[9-11]。

目前，硝基呋喃類代謝物檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫分析法[12-15]等。高效液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)雖檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但需要專業(yè)技術(shù)人員操作且過程復(fù)雜、設(shè)備昂貴?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析法將化學(xué)發(fā)光法和酶免疫分析法結(jié)合起來[16-17]，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)、且操作簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)，更適用執(zhí)法人員現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。楊武英等[15]建立了蝦肉中呋喃它酮代謝物化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，IC50為1.38 ng/mL，LOD為0.09 ng/mL。2013年，何方洋等[18]用間接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法制備呋喃它酮代謝物檢測(cè)試劑盒，畜禽組織和水產(chǎn)品LOD為0.1 ng/mL，2014年[19]用“包被抗原-酶標(biāo)抗體”直接CLEIA法制備試劑盒，IC50為0.198 ng/mL。馮才偉等[20]用間接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法，對(duì)豬肉、豬肝、雞肉等樣品呋喃它酮代謝物進(jìn)行了檢測(cè)，LOD為0.086～0.094 ng/mL。Ying-Chun Liu等[21]對(duì)魚肉、雞蛋、蜂蜜等樣品中該物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)，LOD為0.01 ng/mL。本文對(duì)呋喃它酮代謝物AMOZ進(jìn)行衍生化，活化酯法合成酶標(biāo)抗原，建立“包被抗體-酶標(biāo)抗原”直接競(jìng)爭(zhēng)CLEIA法，對(duì)實(shí)驗(yàn)中包被抗體稀釋倍數(shù)、酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)、包被條件、封閉液、競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，從精密度、準(zhǔn)確性、特異性方面對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)估，以期得到一種適用于實(shí)際樣品快速篩查的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

AMOZ單克隆抗體 北京艾旗斯德科技有限公司提供；5-嗎啉-3-[（2-硝基基苯基）-甲基]氨基-2-唑烷酮（NPAMOZ）標(biāo)準(zhǔn)品（99.9%）、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃妥因、AMOZ、氨基脲（SEM）、3-氨基-2-惡唑烷酮（AOZ）、1-氨基乙內(nèi)酰脲（AHD）、N-羥基琥珀亞胺（NHS）、魯米諾、碳化二亞胺（DCC）、卵清蛋白（OVA）、辣根過氧化物酶（HRP）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、2-硝基苯甲醛、對(duì)醛基苯甲酸（4-CBA）、1-（2硝基苯亞甲基）-氨基乙內(nèi)酰脲（NPAHD）、1-（2硝基苯亞甲基）-氨基乙內(nèi)酰脲（NPAOZ）、2-硝基苯亞甲基-氨基脲（NPSEM） 美國(guó)Sigma公司；KCl、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、對(duì)碘苯酚、對(duì)甲苯酚、過氧化氫脲、乙酸乙酯、正己烷 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純；雞胸肉 市購。

BSA224S電子天平 德國(guó)Sartorius公司；單道微量移液器 0.5～10 μL、10～100 μL、96孔可拆卸化學(xué)發(fā)光板，美國(guó)Thermo公司；8通道移液器 30～300 μL，德國(guó)Eppendorf公司；1000～5000 μL移液器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UPT-I-10T超純水機(jī) 四川優(yōu)普超純科技有限公司；SC-3610低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；UV-1600PC紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；INFINITE 200PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；AVANCE 600MHZ超導(dǎo)核磁共振波譜儀 德國(guó)Bruker公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液系統(tǒng) 包被緩沖液（pH9.6，0.05 mol/L）、PBS緩沖液（pH7.4，0.01 mol/L）、PBST洗滌液（pH7.4，0.01 mol/L）、封閉液、終止液均參照文獻(xiàn)[15]方法配制。魯米諾儲(chǔ)備液（0.25 mol/L）：0.4429 g魯米諾，溶于10 mL DMF。過氧化氫脲儲(chǔ)備液（0.3 mol/L）：0.2822 g過氧化氫脲溶于10 mL超純水。對(duì)碘苯酚儲(chǔ)備液（0.01 mol/L）：0.0220 g對(duì)碘苯酚溶于10 mL DMF。對(duì)甲苯酚儲(chǔ)備液（0.01 mol/L）：0.0108 g對(duì)甲苯酚溶于10 mL DMF。

1.2.2 AMOZ衍生物半抗原5-嗎啉-3-[（4-羧基苯基）-甲基]氨基-2-僫唑烷酮（CPAMOZ）的合成75.0 mg AMOZ溶于937.5 μL 0.1 mol/L HCl，得溶液A；60.0 mg對(duì)醛基苯甲酸4-CBA溶于937.5 μL DMF，得溶液B；A與B混勻后室溫反應(yīng)48 h?；旌弦?500 r/min離心10 min，棄上清液，乙醇洗沉淀3次，烘干，得白色固體粉末CPAMOZ[22]。

1.2.3 酶標(biāo)抗原的合成 30.0 mg CPAMOZ，15.8 mg NHS，28.5 mg DCC，混合溶于350 μL DMF，室溫下反應(yīng)16 h，得溶液D。19.6 mg辣根過氧化物酶HRP，溶于1 mL pH7.4的PBS，加入D溶液，4℃反應(yīng)過夜。混合液轉(zhuǎn)移到透析袋，室溫下PBS透析5 d，每隔8 h換一次透析液。透析后混合液4500 r/min離心15 min，上清液加入等體積甘油，分裝，－20℃保存?zhèn)溆肹23]。

1.2.4 直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法（dc-CLEIA）檢測(cè)步驟 單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液（CBS）包被液稀釋后依次加入到96孔化學(xué)發(fā)光板中，100 μL/孔，孵育2～16 h。PBST洗板3次。每孔200 μL封閉液，37℃封閉2 h，每孔依次加入50 μL梯度稀釋標(biāo)品NPAMOZ溶液與50 μL酶標(biāo)抗原，空白對(duì)照以標(biāo)品稀釋液代替標(biāo)品，37℃進(jìn)行孵育30～150 min，洗板4次。將發(fā)光液混合后立即加入，100 μL/孔，室溫下避光反應(yīng)1～5 min后用INFINITE 200PRO酶標(biāo)儀測(cè)化學(xué)發(fā)光值RLU。

1.2.5 dc-CLEIA各參數(shù)優(yōu)化

1.2.5.1 化學(xué)發(fā)光液優(yōu)化 將魯米諾儲(chǔ)備液、對(duì)甲苯酚和對(duì)碘苯酚儲(chǔ)備液、過氧化氫脲儲(chǔ)備液、30%H2O2配制成不同摩爾比的化學(xué)發(fā)光液組合，見表1，通過RLU值比較選出最佳發(fā)光液。

表1 化學(xué)發(fā)光液優(yōu)化Table 1 Chemiluminescence solution optimization

1.2.5.2 化學(xué)發(fā)光板均一性測(cè)定 在化學(xué)發(fā)光板中隨機(jī)抽取3條，根據(jù)1.2.4中檢測(cè)步驟進(jìn)行包被，封閉后加入100 μL/孔發(fā)光液，根據(jù)各孔R(shí)LU值計(jì)算孔間變異系數(shù)。

1.2.5.3 優(yōu)化包被抗體和酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù) 采用棋盤法[15]進(jìn)行確定，將包被抗體按1000、2000、4000、8000、16000稀釋倍數(shù)縱向包被，將酶標(biāo)抗原按40、80、160、320、640、1280稀釋倍數(shù)橫向加入酶標(biāo)板，競(jìng)爭(zhēng)物NPAMOZ濃度為100 ng/mL，以添加標(biāo)品的RLU值為B，不添加標(biāo)品的RLU值為B0，計(jì)算B/B0，根據(jù)B/B0比值最小選取最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.5.4 包被條件優(yōu)化 在選擇最佳包被抗體和酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)基礎(chǔ)上，設(shè)置4℃包被過夜、37℃放置2 h后4℃過夜、37℃放置2 h三個(gè)包被條件，每組設(shè)三個(gè)平行。

1.2.5.5 封閉液優(yōu)化 在選擇最佳包被抗體量、酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)、包被條件基礎(chǔ)上，以1%脫脂乳粉、1% BSA、1%明膠為封閉液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)三個(gè)平行。

1.2.5.6 競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間優(yōu)化 在選擇最佳包被抗體量、酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)、包被條件、封閉液基礎(chǔ)上，設(shè)置45、60、120、150 min四個(gè)競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)三個(gè)平行。

以上各參數(shù)最佳值以RLUmax/IC50、半抑制濃度IC50為判斷依據(jù)，RLUmax/IC50越大，IC50越小，則實(shí)驗(yàn)靈敏度越高。

1.2.6 dc-CLEIA方法學(xué)評(píng)估

1.2.6.1 dc-CLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與靈敏度的測(cè)定 經(jīng)過各參數(shù)優(yōu)化，以抑制率為縱坐標(biāo)，NPAMOZ log濃度為橫坐標(biāo)，繪制dc-CLEIA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算該方法靈敏度IC50、線性范圍和最低檢測(cè)線IC10。

抑制率=（不添加標(biāo)品孔R(shí)LU值-添加標(biāo)品孔R(shí)LU值）/（不添加標(biāo)品RLU值-空白孔R(shí)LU值）

1.2.6.2 精密度測(cè)定 以變異系數(shù)來反映方法精密度，取5個(gè)不同濃度的NPAMOZ標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行dc-CLEIA分析，每個(gè)濃度做5個(gè)平行，分批進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，將得到RLU值進(jìn)行批內(nèi)和批間差異分析。

1.2.6.3 特異性測(cè)定 特異性以交叉反應(yīng)率來反映，將呋喃它酮結(jié)構(gòu)類似物呋喃妥因、呋喃西林、呋喃唑酮、AHD、SEM、AOZ、NPAMOZ、NPAHD、NPSEM、NPAOZ分別配制成100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng/mL系列濃度，作為酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)物，按dc-CLEIA檢測(cè)步驟測(cè)定，求出各自結(jié)構(gòu)類似物IC50值，計(jì)算交叉率CR：

CR（%）=IC50（NPAMOZ）/IC50（類似物）×100

1.2.6.4 準(zhǔn)確性測(cè)定 準(zhǔn)確性以加標(biāo)回收率來反映，采用該方法對(duì)雞肉樣品AMOZ添加進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)添加濃度3個(gè)平行，計(jì)算樣品AMOZ平均回收率。

樣品前處理方法：50 g雞胸肉均質(zhì)，均質(zhì)后稱取2 g樣品共4份，每份樣品加9 mL超純水，4份樣品中分別加AMOZ標(biāo)品，濃度分別為0、0.5、1.0、2.0 ng/g。攪拌均勻，每份樣品加1 mL 1 mol/L HCl，200 μL 2-硝基苯甲醛，將處理好樣品混合液置于37℃培養(yǎng)箱中振蕩16 h。振蕩后，每份混合液加10 mL 0.1 mol/L K2HPO4，0.8 mL 1 mol/L NaOH，10 mL乙酸乙酯，4500 r/min離心15 min，吸取乙酸乙酯上清液，氮?dú)獯蹈?，在吹干樣品中? mL正己烷，晃蕩30 s，加1 mL PBS，室溫4500 r/min離心10 min，取下層溶液備用。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMOZ衍生物半抗原（CPAMOZ）鑒定

由表2和圖1可知，有對(duì)醛基苯甲酸（4-CBA）與AMOZ連接的H存在，即表中④H存在，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)式，說明4-CBA與AMOZ連接成功，證明CPAMOZ成功合成。

表2 CPAMOZ氫譜分析結(jié)果Table 2 The 1HNMR analysis results of CPAMOZ

圖1CPAMOZ結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of CPAMOZ

圖2 活化酯法酶標(biāo)抗原CPAMOZ-HRP、CPAMOZ和HRP紫外掃譜圖Fig.2 The activated ester method UV spectrum of CPAMOZ-HRP，CPAMOZ and HRP

2.2 酶標(biāo)抗原合成鑒定

紫外圖譜見圖2。HRP載體蛋白最大紫外吸收峰在403 nm，半抗原CPAMOZ的最大紫外吸收峰在293 nm，CPAMOZ與HRP偶聯(lián)后，CPAMOZ-HRP最大紫外吸收峰在289 nm和407 nm。CPAMOZ-HRP紫外吸收峰包括了CPAMOZ和HRP，并相對(duì)于CPAMOZ和HRP紫外吸收峰都發(fā)生了明顯偏移，且吸收曲線也發(fā)生了明顯變化，說明CPAMOZ-HRP偶聯(lián)成功。

2.3 化學(xué)發(fā)光液的選擇

表1中1～8組濃度比例不同的發(fā)光液組合的RLU值見圖3。化學(xué)發(fā)光值越大，則檢測(cè)靈敏度相對(duì)較好。從圖3中看出，發(fā)光增強(qiáng)劑對(duì)碘苯酚（1～4組）比對(duì)甲苯酚（5～8組）的RLU值大，對(duì)碘苯酚（1～4組）的RLU值在50萬以上，而對(duì)甲苯酚RLU值則保持在1萬到2萬間，故選擇對(duì)碘苯酚為發(fā)光增強(qiáng)劑。在對(duì)碘苯酚作為增強(qiáng)劑前4組中，使用H2O2作為氧化劑1組和3組，隨著時(shí)間推移，RLU值下降程度大，而使用過氧化氫脲作為氧化劑2組和4組，RLU值隨著時(shí)間延長(zhǎng)比較平緩，H2O2隨著時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)自動(dòng)分解，故選擇過氧化氫脲作為氧化劑；2組比4組RLU值大，且6 min內(nèi)第2組RLU值是增大的，故選擇2組化學(xué)發(fā)光液組合即魯米諾5 mmol/L、對(duì)碘苯酚7 mmol/L、過氧化氫脲3 mmol/L作為最佳組合。

圖3 化學(xué)發(fā)光液的優(yōu)化RLU值Fig.3 The optimization RLU of chemiluminescent solution

2.4 化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板均一性

從表3中看出，化學(xué)發(fā)光板變異系數(shù)為2.52%，說明各孔間的均一性良好[24]。

2.5 包被抗體與酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)確定

由表4可看出，隨著抗體包被量減少或酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)增大，B0值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，根據(jù)棋盤法和B/B0，選擇抗體稀釋倍數(shù)為8000倍，酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)為160倍，這時(shí)B/B0值最小，即方法靈敏度最高。

2.6 包被條件確定

從圖4中看出，4℃過夜和37℃放置2 h后4℃過夜組IC50接近，且37℃放置2 h后4℃過夜組的RLUmax/ IC50大于其它兩組，即此組靈敏度最好，能使抗體更好吸附于固相載體上，選擇37℃放置2 h后4℃過夜組為最佳包被條件。

表3 化學(xué)發(fā)光板均一性數(shù)據(jù)Table 3 The homogeneity of chemical luminous plate

圖4 不同包被條件對(duì)直接競(jìng)爭(zhēng)法的影響Fig.4 The effect of different coating method for dc-CLEIA

2.7 封閉液確定

從圖5看出，1%明膠組RLUmax/IC50明顯大于1%脫脂乳粉組和1%BSA組，但在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，用明膠封閉完洗板，板底部明膠很難清洗干凈，背景值大，故它的RLU值明顯大于其他兩組，IC50也大，比其他組大一個(gè)數(shù)量級(jí)，造成用明膠封閉的靈敏度降低；1%BSA的RLUmax/IC50大于1%脫脂乳粉，而兩個(gè)組IC50接近，故選擇1%BSA作為本實(shí)驗(yàn)最佳封閉液。

表4 直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫法棋盤格數(shù)據(jù)Table 4 The checkerboard experiment data of dc-CLEIA

2.8 競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間確定

從圖6可以看出，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，IC50和RLUmax/IC50呈上升趨勢(shì)，150 min時(shí)，IC50比其他三個(gè)時(shí)間下均大，IC50為方法學(xué)靈敏度，說明150 min時(shí)實(shí)驗(yàn)靈敏度降低程度大，選擇150 min不適宜，60 min與120 min時(shí)的IC50接近，反應(yīng)基本達(dá)到平衡，60 min時(shí)的RLUmax/ IC50值大，所以選擇競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間為60 min。

圖5 不同封閉液對(duì)直接競(jìng)爭(zhēng)法的影響Fig.5 The effect of different blocking solution for dc-CLEIA

圖6 競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間對(duì)直接競(jìng)爭(zhēng)法的影響Fig.6 The effect of competitive time for de-CLEIA

2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)優(yōu)化后各參數(shù)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。線性方程為y=0.2499x－0.1976，根據(jù)曲線計(jì)算出IC50為0.62 ng/mL，最低檢測(cè)限IC10為15.52 pg/mL，線性范圍（IC20～I(xiàn)C80）為0.038～9.78 ng/mL。

圖7 dcCLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of dcCLEIA

2.10 精密度測(cè)定

從表6看出，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，表明建立dcCLEIA方法精密度較好[24]。

2.11 特異性測(cè)定

結(jié)果見表7。呋喃它酮原藥IC50為78.2 ng/mL，CR為0.80%，除與呋喃它酮交叉外，與其他結(jié)構(gòu)類似物交叉率均小于0.01%，說明該方法特異性良好。

表6 NPAMOZ化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法的精密度Table 6 Precision of NPAMOZ dcCLEIA

表7 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法的特異性Table 7 The specificity of CLEIA

2.12 回收率測(cè)定

結(jié)果見表8。該方法檢測(cè)AMOZ回收率在83%～94%之間，變異系數(shù)在4.24%～7.03%之間，說明該方法準(zhǔn)確性良好。

表8 樣品添加AMOZ回收率測(cè)定Table 8 Recoveries of AMOZ from different animal tissues

3 結(jié)論

本文建立了呋喃它酮代謝物AMOZ直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法，通過對(duì)各項(xiàng)參數(shù)優(yōu)化，該方法IC50為0.62 ng/mL，檢測(cè)限為15.52 pg/mL，其最低檢測(cè)限低于國(guó)標(biāo)[25]中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測(cè)限0.5 μg/kg和我國(guó)出入境行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[26]中ELISA法檢測(cè)限0.1 μg/kg，可以滿足標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)呋喃它酮代謝物限量要求。該方法特異性良好，除了與呋喃它酮原藥有一定交叉外，與其他結(jié)構(gòu)類似物無交叉，由于呋喃它酮原藥在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，故在實(shí)際樣品檢測(cè)中不會(huì)發(fā)生。通過對(duì)雞肉樣品中添加不同濃度的AMOZ，回收率（83%～94%）較好，為進(jìn)一步檢測(cè)AMOZ殘留檢測(cè)提供了便捷、準(zhǔn)確的方法，也為下一步制備檢測(cè)AMOZ殘留化學(xué)發(fā)光酶免疫試劑盒提供了基礎(chǔ)。

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Development of a direct competitive chemiluminescent enzyme immunoassay for detection of furaltadone metabolite

LV Yue-xia1，WANG Rui1，HUANG Deng-yu1，*，WANG Yun-gui2，LI Tao3
（1.School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shenzhen Bioeasy Technology，Inc.，Shenzhen 518101，China；3.Shanxi Vanguard Technology Co.，Ltd.，Taiyuan 030006，China）

A direct competitive chemiluminescent enzyme immunoassay method（dc-CLEIA）for detection of AMOZ which based on lodine phenol enhancer Luminol-HRP-H2O2system was developed.The 3-amino-5-morpolinomethyl-2-oxazolidinone was metabolite of furaltdone.The sensitivity（IC50）and detection limit（LOD）of the method were 0.62 ng/mL and 15.52 pg/mL respectively.The linear range was 0.038～9.78 ng/mL.The relative standard deviations was below 10%.The antibody was high specific for furaltdone derivative and no cross-reactivity except the furaltdone original drug.The accuracy of the method was verified and the recovery in chicken tissues was 83%～94%.The method provided a convenient，accurate and rapid screening means for detecting AMOZ in actual animal tissue.

furaltdone metabolite；dc-CLEIA；chicken

TS207.3

A

1002-0306（2015）22-0071-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.006

2015－03－20

呂月霞（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：yuexialv2008@163.com。

*通訊作者：黃登宇（1968-），男，博士，副教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全，食品新工藝與食品安全，E-mail：Huangdy110@126.com。