陶瓷膜微濾對馬氏珠母貝肉酶解液理化特性的影響

張曉瑜，楊 萍，洪鵬志，周春霞

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江524088）

陶瓷膜微濾對馬氏珠母貝肉酶解液理化特性的影響

張曉瑜，楊 萍*，洪鵬志，周春霞

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東湛江524088）

以馬氏珠母貝肉蛋白酶解液為原料，考察200 nm陶瓷膜微濾處理對酶解液色值、澄清度、蛋白質含量和分子量分布的影響。結果表明，200 nm陶瓷膜微濾處理可以改善酶解液的色值和澄清度，可以完全截留分子量15000 u以上的蛋白，能夠截留絕大部分分子量10000 u以上的多肽，而分子量小于5000 u的多肽在透過液中得到了有效的富集。

馬氏珠母貝肉，酶解，陶瓷膜，微濾

陶瓷膜是以氧化鋁、氧化鈦、氧化鋯等材料經過特殊的工藝制備而成的多孔非對稱性膜，陶瓷膜過濾是一種“錯流過濾”形式的流體分離過程，由于陶瓷膜機械強度大、耐磨性好、耐高溫、耐酸、耐堿、耐有機溶劑、濃縮倍數高、流速大、易清洗等優點在食品領域的應用日益廣泛。目前，有研究陶瓷膜對果汁的澄清[1]、蛋白濃縮[2]、酪蛋白與乳清蛋白的分離[3]、醬油除雜[4]的結果報道，也有研究認為陶瓷膜可以去除大分子物質[5-6]，使物料穩定性增強，防止沉淀。但是，對于陶瓷膜對大分子蛋白或肽的截留情況未見報道。

馬氏珠母貝肉蛋白質含量高，蛋白質營養價值也高，是優質的蛋白質源，牛磺酸、多糖等含量高[7]，已有許多關于利用馬氏珠母貝制備海洋調味料[8-9]、活性物質[10-11]的研究報道，其中大多采用可控酶解法。然而，馬氏珠母貝肉酶解液渾濁情況嚴重，顏色深暗，有腥苦味，這給開發利用帶來極大阻礙，為此，研究者對馬氏珠母貝肉酶解液澄清、分級與脫腥苦味進行了探討[12-13]，并取得了一定的成果。本文采用陶瓷膜微濾處理馬氏珠母貝肉酶解液，考察其對澄清、脫色與分子量分布的影響，旨在為馬氏珠母貝肉酶解液的開發利用前處理提供新途徑，為陶瓷膜在水產蛋白酶解液中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬氏珠母貝肉 解凍后洗凈瀝干，備用；中性蛋白酶（20萬U/g） 購于廣西南寧龐博生物工程有限公司；肽標準品：磷酸丙糖異構酶（Triosephosphate isomerase，26625 u）、肌紅蛋白（Myoglobin，16950 u）、α-乳清蛋白（α-Lactalbumin，14437 u）、抑肽酶（Aprotinin，6512 u）、氧化胰島素b鏈（Oxidized Insulin b chain，3496 u）、桿菌肽（Bacitracin，1423 u） 購于BIO BAD公司。

WTM-CM-01無機陶瓷膜分離設備 杭州沃騰膜工程有限公司；陶瓷膜（管） 膜過濾有效面積為0.12 m2；AKTA pulifier100蛋白質快速純化系統 美國GE公司；UV-8000紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；三足式離心機 上海地元離心機有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解工藝流程 取洗凈瀝干后的馬氏珠母貝肉9.52 kg，根據本實驗優化的酶解條件：按料水比為1∶1.5的比例加入14.28 kg的水，攪拌均勻后倒入酶解罐中，升溫至55℃，按照0.3%比例加入中性蛋白酶28.56 g，于55℃酶解3 h。然后升溫至85℃，滅酶10 min，冷卻后用三足式離心機離心過濾去渣，所得濾液為酶解液。

1.2.2 陶瓷膜微濾 采用膜孔徑為200 nm的無機管式陶瓷膜，開啟泵，調節頻率為50 Hz，進口壓力0.2 MPa左右，對酶解液進行循環式微濾。當微濾截留液體積約為酶解液體積的10%時，停止操作，得到透過液與截留液。

1.2.3 可溶性固形物含量的測定 采用折光法，手持折光儀進行測定[14]。

1.2.4 蛋白質含量的測定 采用微量凱氏定氮法[14]。

1.2.5 色值的測定 以蒸餾水為參照液，用分光光度計在420 nm波長測定吸光度，用A420nm表示[15]。

1.2.6 澄清度的測定 以蒸餾水為參照液，用分光光度計在680 nm波長測定透光率，用澄清度T（%）表示[16]。

1.2.7 分子量分布分析 采用凝膠色譜法，檢測條件：AKTA purifier 100蛋白分析純化系統，Superdex peptide 10/300 GL分析柱；洗脫液：Tris-HCl緩沖液（pH7.5，0.02 mol/L）；流速：0.7 mL/min；檢測波長：214 nm；進樣量：20 μL。

2 結果與分析

2.1 分子量測定標準曲線

標準品及洗脫體積如表1所示，以分子量的對數值（lgMw）對洗脫體積作線性回歸得到分子量曲線方程為：y=－0.0783x+4.9232（R2=0.9615）。

表1 標準物質的分子量和洗脫體積Table 1 Chromatographic data for preparing standard curve for molecular weight determination

2.2 微濾前后酶解液理化指標的變化

表2 微濾處理前后酶解液的理化指標Table 2 Physicochemical index of the hydrolysates before and after micro-filtration

由表2可知，酶解液經過陶瓷膜微濾后，透過液中可溶性固形物含量明顯減少，而截留液中固形物含量較高，說明酶解液中一些大分子可溶性物質如糖類等不能透過陶瓷膜而被截留。

透過液的蛋白質含量相比酶解液減少，表明陶瓷膜微濾對于大分子蛋白質有截留作用；還有可能是在微濾結束時，有一部分酶解液滯留在管道中，致使一部分蛋白質留在截留液中造成損失。截留液相較于酶解液有一定程度的濃縮，蛋白質濃度增加，含量增加。

馬氏珠母貝肉的酶解液呈灰綠色、渾濁、有沉淀，透過液為淡黃色、澄清透亮、無雜質和沉淀。酶解液經過微濾后，色值明顯減少而澄清度明顯增加，說明陶瓷膜微濾對于酶解液的色值和澄清度均有明顯的改善作用。

2.3 酶解液及其透過液和截留液的液相色譜分析

圖1 酶解液的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of enzymatic hydrolysates

圖2 微濾透過液的液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of permeate liquid

由圖1和圖2對比可以看出，原本出現在酶解液的色譜圖中，保留體積在6.93 mL左右的吸收峰在透過液的色譜圖（圖2）中消失，而圖3截留液的色譜圖中，出現了保留體積在6.96 mL左右的吸收峰，可見酶解液經過微濾后，這些大分子的蛋白質被截留。由圖2可以看出，透過液的吸收峰的保留體積出現在9.69 mL，從標準曲線找到對應的lgMw=4.1893，求得相對分子質量為15463 u，表明酶解液經過微濾后，分子量大于15000 u的蛋白質被全部除去。

圖3 微濾截留液的液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of rejected fluid

由圖1和圖3的對比可知，截留液中保留體積在6.9 mL左右的吸收峰遠遠高于其他保留體積的吸收峰，而酶解液中，保留體積在6.9 mL左右的吸收峰略低于其他保留體積的吸收峰，說明酶解液經過微濾后，未被分解的大分子蛋白質和一些肽等在截留液中的含量升高，表明微濾對大分子蛋白質和肽具有截留作用。

為了進一步分析陶瓷膜微濾前后酶解液中各肽段的變化，對酶解液、透過液和截留液的色譜圖進行積分，利用標準曲線得到肽的相對分子質量分布并計算不同分子量肽段的百分比，結果如表3所示。

表3 酶解液中不同分子量肽段的百分比Table 3 The percentage of different molecular mass peptide in hydrolysates

由表3可以看出，與酶解液相比，透過液中肽的相對分子質量分布總體表現為5000 u以下的肽含量增加，5000 u以上的肽含量減少，尤其以10000 u以上的肽含量明顯減少。

透過液中主要包括2500～5000 u和小于2500 u這兩個區段的肽，分別占36.3%和32.95%。其中2500～5000 u這個區段的肽在透過液中得到了較好的富集，微濾后含量增加較明顯，由27.63%增加到36.3%；小于2500 u的小分子肽在微濾后含量也有一定的增加，由28.38%增加到32.95%，表明陶瓷膜微濾對小于2500 u的肽也有一定的富集作用。對比酶解液和透過液可以看出，微濾后，分子量為5000 u以下的肽的含量由56.01%增加到69.25%，表明微濾對5000 u以下的肽有富集作用；而5000～10000 u這個區段的多肽在微濾后含量由33.34%減少到29.55%，說明這個區段的肽段在微濾后有一小部分被陶瓷膜截留，微濾對分子量在5000～10000 u的多肽有一定的截留作用。

截留液中小于2500 u和2500～5000 u這兩個區段的肽的含量明顯下降，分別由28.38%下降到17.5%、由27.63%下降到19.82%，說明5000 u以下的小分子肽更多的穿過陶瓷膜進入到透過液中，同樣說明微濾對5000 u以下的肽具有很好的富集作用。

相比酶解液，截留液中分子量為10000 u以上的肽段的含量明顯增加，而透過液中10000 u以上的多肽基本被除去，只有1.18%，表明酶解液經過陶瓷膜微濾后，10000 u以上的大分子肽段基本上能夠被陶瓷膜截留。李雨哲等[12]在研究馬氏珍珠貝酶解液澄清工藝中指出，酶解液中的渾濁物質主要是分子量大于10000 u的肽段，殼聚糖能夠與分子量大于10000 u的肽段發生靜電吸附而使酶解液澄清，由此推測陶瓷膜微濾和殼聚糖處理酶解液有相似的澄清效果。

由表3中酶解液、透過液和截留液的分子量分布可以看出，陶瓷膜微濾并不能嚴格的按照分子量大小對多肽進行分離。事實上，透過液中也含有大分子肽，而截留液中也含有一些小分子肽。這可能是由于一方面酶解液中肽的分子結構大部分呈線性結構，在膜附近由于肽自身的可變范圍較大，再加上跨膜壓力的驅動作用，從而使部分相對分子質量較大的多肽通過陶瓷膜進入透過液[17]；另一方面在全回流的微濾方式下，處理一段時間后，大分子蛋白質在膜上不斷累積，形成凝膠層，而凝膠層的形成可能會阻止一些相對分子質量較小的肽通過膜[18]，從而使其被截留在微濾截留液中。

3 結論

本研究結果表明，200 nm陶瓷膜微濾處理可以使酶解液中5000 u以上的大分子肽含量減少，5000 u以下的小分子肽含量增加，能完全截留15000 u以上的蛋白質分子，而對于絕大部分10000 u以上的多肽和部分5000～10000 u的肽能有效的截留；對于5000 u以下的小分子肽具有有效的富集作用，其中小于2500 u和2500～5000 u的多肽都得到了很好富集。同時，200 nm陶瓷膜微濾還可以明顯改善酶解液的色值和澄清度。因此，陶瓷膜微濾技術可以作為一種分離和富集馬氏珠母貝肉酶解液中活性肽的手段，本文的研究可以為從貝類酶解液分離提純活性肽提供理論和方法上的參考。

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Effects of micro-filtration by ceramic membrane on physicochemical properties of enzymatic hydrolysates of Pinctada martensii meat

ZHANG Xiao-yu，YANG Ping*，HONG Peng-zhi，ZHOU Chun-xia
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，Zhanjiang 524088，China）

The effects of micro-filtration by ceramic membrane with pore size of 200 nm on enzymatic hydrolysates of Pinctada martensii meat were studied.The results showed that the color value and clarify of the enzymatic hydrolysates were ameliorated and all proteins with the molecular mass of more than 15000 u and most peptides with the molecular mass of more than 10000 u could be cut off and peptides with the molecular mass of less than 5000 u were enriched effectively in the permeation fraction.

Pinctada martensii meatatio；enzymatic hydrolysis；ceramic membrane；micro-filtration

TS254.1

A

1002-0306（2015）22-0097-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.011

2014－12－26

張曉瑜（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：水產品高值化加工與利用，E-mail：799401053@qq.com。

*通訊作者：楊萍（1964-），女，碩士，教授，研究方向：水產品高值化加工與利用，E-mail：50299052@163.com。

863計劃項目（2013AA102201）；創新強校工程項目（GDOU2014050203，GDOU2013050313）。