明膠對甲醛捕獲條件的研究

儀淑敏，楊立平，李學鵬，徐永霞，李穎暢，勵建榮

（渤海大學食品科學研究院，渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧錦州121013）

明膠對甲醛捕獲條件的研究

儀淑敏，楊立平，李學鵬，徐永霞，李穎暢，勵建榮*

（渤海大學食品科學研究院，渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧錦州121013）

為了開發出能應用于食品中的新型甲醛捕獲劑，本文以明膠為研究對象，采用單因素實驗分析了時間、溫度、pH、濃度對明膠與甲醛的反應特性。在單因素實驗的基礎上，以甲醛捕獲率為響應值，通過Box-Behnken中心組合實驗對明膠作為甲醛捕獲劑的捕獲條件進行優化，進一步研究了明膠對甲醛的捕獲特性，結果表明明膠的最佳捕獲條件為：捕獲時間10 h、捕獲溫度30℃、pH8.0、明膠濃度1.0%，甲醛捕獲率可達80.97%。

明膠，甲醛，捕獲條件

甲醛又稱蟻醛，微帶酸性，具有強烈的刺激性氣味，對人和動物具有較高的毒性，對神經系統、肺和肝臟均可產生損害[1]。國家標準規定甲醛不能作為食品添加劑應用于食品。但是近年來，食品中經常檢測出甲醛，引起人們的廣泛關注[2]。Rodriguez[3]調查了冷藏過程中的魷魚、鱈魚、沙丁魚等中甲醛本底含量，發現最高含量達41 mg/kg；Fu等[4]研究了甲醛的產生原因，發現高溫作用有助于氧化三甲胺分解為甲醛和二甲胺；Herrera等[5]研究了抑制甲醛產生的途徑，發現抗凍劑可抑制甲醛的產生。

甲醛捕獲劑又稱甲醛清除劑、甲醛消納劑或甲醛捕捉劑，是指在一定條件下能與甲醛發生化學反應的化合物的水溶液[6]。目前甲醛捕獲劑種類較多，但大多數都存在缺陷，如二次污染、影響產品性能、不適合在食品中應用等[7]，俞其林[8]發現茶多酚能夠顯著降低秘魯魷魚絲中甲醛含量。開發出適用于食品行業的綠色新型甲醛捕獲劑是當前研究熱點[9]。

明膠是動物的皮、骨等通過部分酸法、堿法水解或酶解，提純而獲得的膠原蛋白[10]。是一種將膠原三螺旋結構轉化為無規則鏈而獲得的蛋白質，具有生物可降解性及良好的生物相容性[11]，因此在醫藥與食品上得到廣泛的應用。Fahmi等[12]曾利用海鯛魚明膠制備血管緊張素轉換酶活性抑制肽，任龍芳等[13]比較了明膠、骨膠和氨基酸的除醛效果，其中明膠的甲醛去除率最高，達到50%。本實驗對明膠捕獲甲醛的條件進行了優化，為開發出適用于食品的甲醛捕獲劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明膠 化學純，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈 色譜純，天津市天立化學試劑有限公司；2，4-二硝基苯肼（DNPH） 分析純，天津市東麗區天大化學試劑廠；甲醇 色譜純，TEDIA公司；甲醛標準溶液 分析純，國家環?？偩?；37%～40%甲醛溶液 分析純，沈陽市華東試劑廠。

Agilent HPLC1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；1004精密電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 明膠與甲醛溶液的反應 將37%～40%的甲醛溶液以適量倍數稀釋（約為10 μg/mL，以甲醛標準溶液濃度為參照），再將明膠配制成一定質量分數的溶液，以甲醛溶液和明膠溶液體積比（v/v）2∶1混合，用NaOH或HCl溶液調pH，搖勻，一定條件反應，反應后定容，充分搖勻。移取樣品溶液4 mL，測定殘余甲醛含量。每次實驗重復三次，同時用蒸餾水代替明膠做空白對照實驗。

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 反應時間對甲醛與明膠反應的影響 取5 mL 1.0%（w/v）的明膠溶液和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在25℃條件下，考察反應時間0、3、6、9、12 h對明膠與甲醛溶液反應的影響。

1.2.2.2 反應溫度對甲醛與明膠反應的影響 取5 mL 1.0%（w/v）的明膠溶液和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在4、20、40、60、80℃水浴中反應12 h，考察反應溫度對明膠與甲醛溶液反應的影響。

1.2.2.3 pH對甲醛與明膠反應的影響 取5 mL 1.0%（w/v）的明膠溶液和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在20℃水浴中反應12 h，考察pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0對明膠與甲醛溶液反應的影響。

1.2.2.4 明膠濃度對甲醛與其反應的影響 取5 mL不同濃度的明膠溶液（0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、5.0%、10.0%，w/v）和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在pH為8.0，溫度為20℃的水浴中反應12 h，考察明膠濃度對其與甲醛溶液反應的影響。

1.2.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上，為進一步研究時間、溫度、pH和明膠濃度對明膠與甲醛反應的影響，設計了4因素3水平的組合實驗，考察時間、溫度、pH和明膠濃度4個因素對甲醛捕獲率的影響。實驗設計如表1。

表1 響應面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels for RSD

1.2.3 甲醛檢測方法 根據勵建榮等建立的方法[14]略有改進，利用高效液相色譜法測定甲醛含量，甲醛與DNPH于60℃水浴衍生生成2，4-二硝基苯腙，經ODS-C18柱分離，紫外檢測器于波長355 nm下檢測，以保留時間定性，峰面積定量，間接測出甲醛含量。測定時取4 mL樣品溶液，加入DNPH衍生劑2 mL，60℃下衍生30 min，流水冷卻，0.45 μm濾膜過濾后，取10 μL進樣檢測。

1.2.4 甲醛標準曲線的繪制 分別取10 μg/mL的甲醛標準液0.00、0.20、0.40、0.80、1.20、2.00 mL于10 mL具塞比色管中，加蒸餾水至4.0 mL。加入0.5 mg/mL的DNPH 2 mL，于60℃水浴中放置30 min，然后在流水中快速冷卻，用0.45 μm濾膜過濾后，取10 μL進樣，測量保留時間和峰面積，每種濃度測定三次，取平均值，用峰面積和甲醛含量繪制標準曲線。

1.2.5 甲醛捕獲率的計算 甲醛捕獲率（%）=（A-X）/A×100；式中：A-甲醛原始含量，μg/mL；X-樣品中甲醛含量，μg/mL。

1.3 數據處理

利用SPSS 18.0的ANOVA作方差分析，差異顯著性p＜0.05；由Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析。

2 結果與討論

2.1 甲醛標準曲線

對實驗結果進行回歸統計，得出甲醛標準曲線線性回歸方程：Y=243.62X+4.00，R2=0.9995。

圖1 甲醛標準曲線Fig.1 The standard curve of formaldehyde

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 反應時間對甲醛與明膠反應的影響 隨著反應時間的延長，甲醛捕獲率顯著增加（p＜0.05）。反應9 h內，甲醛減少量顯著，當反應時間分別為9 h和12 h時，甲醛捕獲率分別為56.47%和59.34%，甲醛的減少趨于平緩，可能是因為反應時間較短時，捕獲劑上的羧基未得到活化，阻礙了反應的順利進行，而當反應進行一段時間后，氨基的數量已達到飽和狀態，所以甲醛捕獲率也相應地達到最大值[15]。

圖2 時間對甲醛與明膠反應的影響Fig.2 The effect of time on reaction of formaldehyde with gelatin

2.2.2 反應溫度對甲醛與明膠反應的影響 4℃時明膠與甲醛的反應活性最低，甲醛的減少量不顯著；隨著溫度的升高，相鄰處理間甲醛減少量的差異顯著（p＜0.05），且溫度為20℃時，甲醛捕獲率達到最大值72.60%，隨著溫度升高甲醛捕獲率逐漸減少，由此可見較高溫度不利于明膠與甲醛發生反應，這可能是明膠自身的羧基和氨基在較高溫度下容易發生自身交聯，減少了氨基與甲醛的結合[15]。因此在實際應用時，可采用20℃左右使甲醛捕獲率達到較好值。

圖3 溫度對甲醛與明膠反應的影響Fig.3 The effect of temperature on reaction of formaldehyde with gelatin

2.2.3 pH對明膠與甲醛反應的影響 在pH1.0～8.0范圍內，隨著pH的增大，甲醛減少量顯著增加（p＜0.05），當pH為8.0時甲醛捕獲率達到72.13%；在pH8.0～10.0范圍內，隨著pH的增大，甲醛捕獲率顯著減少（p＜0.01）；但隨著pH的進一步增大，甲醛含量又相應減少，這是由于甲醛在堿性條件下發生歧化作用，一分子甲醛被氧化成甲酸，另一分子甲醛被還原成甲醇，該反應亦被稱為卡尼查羅（Cannizzaro）反應[16]。由此可見，pH對甲醛與明膠反應影響較大，在實際應用時可采取偏中性環境。

圖4 pH對明膠與甲醛反應的影響Fig.4 The effect of pH on reaction of formaldehyde with gelatin

2.2.4 明膠濃度對甲醛與其反應的影響 明膠與甲醛溶液在20℃、pH8.0的條件下反應12 h，不同濃度的明膠溶液與甲醛反應結果見圖5?？梢缘贸雒髂z濃度對甲醛捕獲率有顯著性影響（p＜0.05），濃度由0.2%升到0.8%時，甲醛捕獲率顯著增加（p＜0.01），再隨著濃度升高，明膠與甲醛的反應將趨于平衡，可能是由于高濃度的明膠溶液本身容易發生交聯，阻止了明膠與甲醛的反應。因此實驗時可選用0.8%左右的明膠溶液，參考圖5，本實驗選取0.5、1.0、1.5進行響應面實驗。

圖5 明膠濃度對甲醛與其反應的影響Fig.5 The effect of concentration on reaction of formaldehyde with gelatin

表2 Box-Behnken實驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

2.3 響應面優化明膠捕獲甲醛的條件

設計4因素3水平的組合實驗，考察溫度、時間、pH和明膠濃度四個因素對明膠與甲醛反應的影響，實驗設計及結果見表2，甲醛捕獲率最高值可達82.12%。對實驗數據進行響應面多元回歸擬合，方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果Table 3 Variance analysis results

由方差分析結果可知，模型F值為11.19，p＜0.0001，表明模型極顯著，說明使用該方程模擬4因素3水平的分析是可行的；失擬項F值為4.08，表明失擬項與凈誤差的發生是不顯著的，其中9.38%的發生機會是由于噪音引起的，失擬項不顯著表明這個模型是合理的；回歸方程的相關系數R2=0.9180，說明響應值的變化有91.80%來源于所選變量，即甲醛捕獲率的變化有91.80%的原因來源于時間、溫度、pH、明膠濃度。在這個模型中B、C、D、AD、BD、B2對甲醛的捕獲影響顯著，說明溫度、pH、明膠濃度及時間與明膠濃度的交互作用、溫度與明膠濃度的交互作用對明膠與甲醛反應的影響較大。在四種因素的交互作用下，各因素對甲醛捕獲率的影響順序是B＞C＞D＞A，即溫度＞pH＞明膠濃度＞時間。因此，該回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以用其確定最佳捕獲條件。

圖6和圖7為響應面曲面圖，從曲面圖可以看出時間對甲醛捕獲率的影響不顯著；溫度對甲醛捕獲率的影響是隨著溫度的升高先升高，再降低，在30～40℃時達到最大值；明膠濃度在中心組合選取的范圍內是隨著濃度的變大，甲醛捕獲率也隨之變大。經過軟件優化實驗的最終理論值為：捕獲時間10.60 h、捕獲溫度30.89℃、pH7.93、明膠濃度1.28%，甲醛捕獲率為83.07%?？紤]到實際操作，將以上條件校正為捕獲時間10 h、捕獲溫度30℃、pH8.0、明膠濃度1.0%，驗證實驗表明此時甲醛捕獲率為80.97%，與理論值較一致。

3 結論

單因素結果表明反應時間、溫度、pH及明膠濃度均可顯著影響明膠對甲醛的捕獲率。

圖7 溫度與濃度曲面圖Fig.7 The surface figure of temperature and concentration

響應面分析確定了明膠對甲醛捕獲的最佳條件：捕獲時間10 h、捕獲溫度30℃、pH8.0、明膠濃度1.0%，甲醛捕獲率為80.97%。其中溫度對反應影響最顯著，其次是pH、明膠濃度，時間最小。

實驗結果表明明膠捕獲甲醛效果顯著，該方法對食品中的甲醛捕獲有良好的應用前景。但是在添加過程中應合理控制食品存放環境的溫度和時間，防止食品變質，影響到產品的其他品質。

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Capture conditions of gelatin with formaldehyde

YI Shu-min，YANG Li-ping，LI Xue-peng，XU Yong-xia，LI Ying-chang，LI Jian-rong*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Jinzhou 121013，China）

In order to develop a new type of formaldehyde capture agent used in food，the characteristics of gelatin with formaldehyde reaction were investigated under time，temperature，pH value and the concentration of gelatin in this paper.Based on single factor test，the Box-Benhnken central composite experimental test was designed by using optimum range for the reactivity of gelatin as formaldehyde scavenger with formaldehyde. The results showed that the optimum gelatin capture conditions：capture time 10 h，trapping temperature 30℃，pH value of 8.0，gelatin concentration 1.0%，formaldehyde capture rate of 80.97%.

gelatin；formaldehyde；capture conditions

TS254.1

B

1002-0306（2015）22-0227-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.039

2015-02-05

儀淑敏（1980-），女，博士，副教授，主要從事水產品貯藏加工及質量安全控制方面的研究，E-mail：yishumin@163.com。

*通訊作者：勵建榮（1964-），男，博士，教授，主要從事水產品、果蔬貯藏加工及安全控制方面的研究，E-mail：lijr6491@163.com。

“十二五”國家科技支撐計劃課題（2012BAD29B06；2015BAD17B01）；國家自然基金（31301418，31201308）；遼寧省食品安全重點實驗室；遼寧省高校重大科技平臺；遼寧省高等學校創新團隊；遼寧省高等學校攀登學者支持計劃。