有機溶劑分級沉淀分離線性β-1，3-葡寡糖

陸光興，羅 宸，+，毛江川，楊 晗，賈 云，蔣巧詩，張洪濤，詹曉北，，*，朱 莉

（1.江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇無錫214125）

有機溶劑分級沉淀分離線性β-1，3-葡寡糖

陸光興1，羅 宸1，+，毛江川1，楊 晗1，賈 云1，蔣巧詩1，張洪濤1，詹曉北1，2，*，朱 莉2

（1.江南大學生物工程學院，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇無錫214125）

鹽酸水解二甲亞砜中的熱凝膠可大規模地制備線性β-1，3-葡寡糖。為了快速高效地分離二甲亞砜中線性β-1，3-葡寡糖，采用不同種類的有機溶劑進行沉淀和分級沉淀。十三種常見有機溶劑中九種可以沉淀熱凝膠水解產物，其中二氯甲烷和乙酸乙酯具有較高的應用可行性。二氯甲烷和乙酸乙酯可以分級沉淀分離線性β-1，3-葡寡糖，乙酸乙酯使用體積較小但選擇性較差。分級沉淀效果受熱凝膠濃度、水含量和離子強度的影響，而不受水解程度的影響。有機溶劑分級沉淀法可以快速高效地終止水解反應和分離水解產物，并可進一步回收二甲亞砜和有機溶劑進行重復利用，對β-1，3-葡寡糖的分離純化具有重要的指導意義。

熱凝膠，線性β-1，3-葡寡糖，二甲亞砜，有機溶劑，分級沉淀

寡糖是由3～10個單糖單元通過糖苷鍵連接構成的低分子碳水化合物[1]。功能性寡糖因具有良好的生物活性廣泛應用于飼料、食品、醫藥、化妝品等領域[2-3]。線性β-1，3-葡寡糖是由葡萄糖通過β-1，3-糖苷鍵連接而成的功能性低聚糖，研究證明其具有抗腫瘤[4]、增強人體免疫力[5]、刺激產生細胞因子[6]和誘導植物抗病[7]等功能。

熱 凝 膠（Curdlan）是一 種 由 土 壤 桿 菌（Agrobacterium sp.）合成[8]的線性β-1，3-葡聚糖，廣泛應用于食品、化工、農業和醫藥工業中[9-10]。二甲亞砜被譽為“萬能溶劑”和“萬能藥”[11]，可用于食品生產[12]和醫藥臨床[13]而不必擔心其毒性。研究發現鹽酸水解溶解于二甲亞砜中的熱凝膠可批量制備線性β-1，3-葡寡糖，并具有價格便宜、高效快速、產品純度高等優點[14]。

目前寡糖分離純化的主要方法為層析或膜分離，層析法[15]存在耗時久、費用高、設備復雜的問題，膜分離法[16]相對而言操作比較簡便、生產過程污染小，但仍需使用特殊設備。分級沉淀是一種簡便快速的分離方法，在生命科學和食品科學中主要用于多糖、蛋白或糖蛋白，沉淀寡糖的報道比較少見或效果不佳。傅赟彬等[14]利用丙酮沉淀二甲亞砜中的熱凝膠水解產物得到聚合度2～19的線性β-1，3-葡寡聚糖，但是并沒有對有機溶劑的種類進行篩選，也沒有利用分級沉淀分離線性β-1，3-葡寡糖。

本文利用鹽酸控溫水解二甲亞砜中的熱凝膠，探索中和法和有機溶劑沉淀法中止水解反應并分離水解產物。利用二氯甲烷和乙酸乙酯分級沉淀分離線性β-1，3-葡寡糖，并探索熱凝膠濃度、水解程度、水含量、離子強度對分級沉淀效果的影響。有機溶劑分級沉淀法既能中止水解反應又能快速高效分離線性β-1，3-葡寡糖，對線性β-1，3-葡寡糖的分離純化具有較好的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熱凝膠 日本武田-麒麟公司，食品級；高效硅膠薄層層析鋁箔板（Silica gel 60 F254） 德國Merck公司；二甲亞砜、濃鹽酸、濃硫酸、NaOH、Na2CO3、濃氨水、甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、苯、丙酮、乙酰丙酮、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、丙醛 國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

AL204型分析天平 梅特勒-托利多儀器公司；852型數顯恒溫磁力攪拌器 金壇市大地自動化儀器廠；XW-80A型旋渦混合器 上海精科實業公司；HH60（0）電子恒溫水浴鍋 蘇州威爾實驗用品有限公司；Sigma 2K5S離心機 Sigma-Aldrich Inc；DHG-9145A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 熱凝膠水解產物的制備 量取50 mL二甲亞砜于100 mL小燒杯中，置于80℃的大功率磁力攪拌器上邊攪拌邊緩慢加入500 mg熱凝膠粉末，繼續加熱攪拌直至形成均一透亮的熱凝膠溶液（10 g/L）。取50 mL離心管分裝10 mL熱凝膠溶液后加入濃鹽酸至鹽酸終濃度0.5 mol/L，封蓋后漩渦振蕩30 s后置于80℃水浴鍋中水解90 min[14]。

1.2.2 中和法中止水解反應 取水解液分別加入三種常用的堿性物質（NaOH、Na2CO3、濃氨水）進行中和，漩渦振蕩3 min使其充分反應繼續調節pH至7.0。10000 r/min離心10 min后取上清進行一次TLC展開分析。

1.2.3 加熱蒸發去除二甲亞砜 取中和水解液加入一倍體積的去離子水，漩渦振蕩30 s混合均勻，分別采用金屬浴加熱、酒精燈加熱和真空旋蒸去除二甲亞砜。金屬浴加熱溫度為110～150℃；真空旋蒸的真空度為-0.1 MPa，溫度為85℃，旋轉速度為100 r/min。

1.2.4 有機溶劑沉淀熱凝膠水解產物 取水解液分別加入1～5倍體積的有機溶劑（甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、丙酮、乙酰丙酮、苯、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、丙醛），高速漩渦振蕩30 s并靜置觀察是否有沉淀析出。10000 r/min離心10 min，倒取上清并將離心沉淀用去離子水復溶到原體積，取上清和沉淀復溶液進行一次TLC展開分析。

1.2.5 二氯甲烷和乙酸乙酯分級沉淀體積的確定取水解液加入1.6～2.0或4.3～5.1倍體積的二氯甲烷，高速漩渦振蕩30 s后10000 r/min離心10 min，倒取上清并將離心沉淀用去離子水復溶到原體積，取上清和沉淀復溶液進行兩次TLC展開分析。另取水解液加入1.9～2.3或3.2～3.6倍體積的乙酸乙酯進行沉淀和分析。

1.2.6 二氯甲烷和乙酸乙酯分級沉淀分離線性β-1，3-葡寡糖 取水解液加入2.0倍體積的二氯甲烷或2.2倍體積的乙酸乙酯，高速漩渦振蕩30 s后10000 r/min離心10 min，倒取上清再分別加入2.7倍體積二氯甲烷或1.2倍體積的乙酸乙酯，高速漩渦振蕩30 s后10000 r/min離心10 min，倒取上清并將兩次離心沉淀用去離子水復溶到原體積，取上清和兩次沉淀復溶液進行兩次TLC展開分析。

1.2.7 熱凝膠濃度對分級沉淀效果的影響 制備10、20、30、40、50、60 g/L的熱凝膠二甲亞砜溶液，分裝10 mL并添加濃鹽酸至鹽酸濃度0.5 mol/L后置于80℃水浴鍋水解90 min，按照1.2.6進行分級沉淀和兩次TLC展開分析。

1.2.8 水解程度對分級沉淀效果的影響 制備10 g/L的熱凝膠二甲亞砜溶液，分裝10 mL并添加濃鹽酸至鹽酸濃度0.5 mol/L后置于80℃水浴鍋分別水解60、80、90、100、120、140 min，按照1.2.6進行分級沉淀和兩次TLC展開分析。

1.2.9 水含量對分級沉淀效果的影響 制備10 g/L的熱凝膠二甲亞砜溶液，分裝10 mL并添加濃硫酸至硫酸濃度0.5 mol/L后置于80℃水浴鍋水解90 min，水解結束后分別添加去離子水至水含量為0、1‰、5‰、1%、5%、10%，按照1.2.6進行分級沉淀和兩次TLC展開分析。

1.2.10 離子強度對分級沉淀效果的影響 制備10 g/L的熱凝膠二甲亞砜溶液，分裝10 mL并添加濃鹽酸至鹽酸濃度0.5 mol/L后置于80℃水浴鍋水解90 min，水解結束后分別添加CaCl2至含量為0、1‰、5‰、1%、5%、10%，按照1.2.6進行分級沉淀和兩次TLC展開分析。

1.2.11 一次TLC展開分析 取1.5 μL待測樣品點到Silica gel 60 F254薄層層析板上（展距10 cm，寬度裁剪到合適長度），展開劑為乙酸-乙酸乙酯-水（V/V/ V=2∶2∶1）。展開完畢后75℃烘干5 min，噴硫酸-乙醇-地衣酚顯色劑（0.2%w/V地衣酚，11%V/V硫酸-乙醇溶液），105℃烘箱烘干5 min顯色[17]。

1.2.12 兩次TLC展開分析 實驗方法同1.2.11，展距20 cm，兩次展開的展開劑為乙酸-乙酸乙酯-水（V/ V/V=2∶2.4∶1.4），一次展開后將TLC板置于鼓風干燥箱75℃烘干5 min，再次置于展開缸中展開分析。

2 結果與分析

2.1 中和法中止反應

圖1 中和反應后上清TLC分析Fig.1 TLC analysis of the supernatant after neutralization reaction

NaOH、Na2CO3和濃氨水都可用于中和HCl，實驗發現NaOH和濃氨水的中和速度較快而Na2CO3中和速度較慢。室溫下NaCl在二甲亞砜中的溶解度只有5 g/L[18]，因此NaOH和Na2CO3中和時生成的NaCl大量沉淀析出，NH4Cl具有一定的溶解度導致濃氨水中和時并未出現沉淀。TLC分析顯示1、2、3的顏色逐漸加深，說明1、2、3的糖含量逐漸升高，因此NaOH和Na2CO3中和生成的沉淀會吸附糖。氨水中和后的混合液則因含鹽高導致顯色斑呈現月牙狀。NaOH既能很快終止反應又能快速除去生成的NaCl，可以用于水解產物分離后二甲亞砜的中和脫鹽。

2.2 加熱蒸發去除二甲亞砜

二甲亞砜常壓沸點高達189℃，含水后沸點下降，因此加入去離子水將有助于二甲亞砜的加熱去除。實驗發現金屬浴加熱在110℃以上時含水溶液發生輕微沸騰，隨著加熱時間的延長蒸發越來越慢，30 min時仍有超過原蒸發體積一半的溶液存在。酒精燈加熱時含水溶液很快發生劇烈沸騰，隨著加熱時間的延長水解液逐漸變為黃色，考慮到DMSO在高溫下穩定性下降，酒精燈加熱不適合二甲亞砜的去除。旋轉蒸發的去除速度和金屬浴相似，旋蒸30 min后還有超過一半體積的溶液存在。因此加熱蒸發不能有效去除二甲亞砜且耗能很大，難以運用到工業化生產中。據報道二甲亞砜做溶劑生產蔗糖酯時工藝簡單、條件溫和、產率高，但最終產品卻難以純化[19]。因此必須探索其他方法分離熱凝膠水解產物與二甲亞砜。

表1 有機溶劑加入10 g/L熱凝膠水解液的現象Table 1 Phenomena after organic solvents added into 10 g/L Curdlan hydrolysis solution

圖2 有機溶劑沉淀10 g/L熱凝膠水解產物Fig.2 Organic solvents precipitate 10 g/L Curdlan hydrolysis product

2.3 有機溶劑沉淀熱凝膠水解產物

沉淀熱凝膠水解產物的有機溶劑需要滿足以下幾個條件：對水解產物的溶解度極低甚至不溶；與二甲亞砜可以互溶；沸點盡量低，方便與二甲亞砜的分離和回收；價格便宜來源廣，便于進行大規模生產；使用安全且不易污染環境。根據以上條件并參照二甲亞砜的溶解度表，篩選以下十三種有機溶劑進行實驗：甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、丙酮、乙酰丙酮、苯、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、丙醛，結果見表1和圖2。

二甲亞砜作為非質子極性溶劑能夠接受熱凝膠分子羥基提供的質子[20]，破壞熱凝膠的分子內氫鍵，將原來纏繞緊密的的棒狀結構變為無規則卷曲狀態。可能因為二甲亞砜搶占了熱凝膠分子內氫鍵形成的基團位置，形成了一種類似于水化層的二甲亞砜層。當在熱凝膠二甲亞砜水解液中加入有機溶劑后溶液的介電常數下降，導致糖分子間的靜電引力增大而相互凝結析出[21]。

二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯等九種有機溶劑可以不同程度地沉淀熱凝膠水解產物。甲醇、乙醇和異丙醇只能沉淀較大分子量的糖，寡糖主要保留在上清液中；二氯甲烷、氯仿、丙酮、苯、乙酰丙酮和乙酸乙酯可以沉淀寡糖，效率由高到低依次為氯仿、苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮和乙酰丙酮。從毒性上分析，苯的毒性最高，氯仿毒性較高，丙酮、二氯甲烷和乙酰丙酮的毒性較低，乙酸乙酯無毒。考慮到沉淀效果、使用安全性、回收難易等因素，二氯甲烷和乙酸乙酯具有較高的應用可行性。

2.4 二氯甲烷和乙酸乙酯分級沉淀體積的確定

圖3 二氯甲烷和乙酸乙酯分級分離線性β-1，3-葡寡糖Fig.3 Linear β-1，3-glucooligosaccharides separation by fractional precipitation of methylene chloride and ethyl acetate

根據水解產物溶解度的不同，可以利用有機溶劑分級沉淀分離不同聚合度的水解產物。隨著有機溶劑加入體積的增大，離心上清中的寡糖種類越來越少，沉淀中的寡糖種類越來越多。為了更好的顯示分級沉淀的效果，可在優化展開劑的基礎上進行兩次展開分析[22]。對于10 g/L的熱凝膠水解液，二氯甲烷沉淀時，2.0倍體積的二氯甲烷沉淀的上清中主要是小分子糖和寡糖如圖3（A），4.7倍體積沉淀時沉淀中主要為寡糖和大分子糖如圖3（B）。乙酸乙酯沉淀時，2.2倍體積的二氯甲烷沉淀的上清中主要是小分子糖和寡糖如圖3（C），4.7倍體積沉淀時沉淀中主要為寡糖和大分子糖如圖3（D）；

由圖3（A）、（C）分析可知2.0倍體積的二氯甲烷或2.2倍體積乙酸乙酯可以較好地沉淀聚合度大于10的大分子糖，由圖3（B）、（D）分析可知4.7倍體積的二氯甲烷或3.4倍體積乙酸乙酯可以較好地沉淀聚合度大于10的大分子糖和寡糖。

2.5 二氯甲烷和乙酸乙酯分級分離線性β-1，3-葡寡糖

圖4 二氯甲烷和乙酸乙酯分級沉淀分離線性β-1，3-葡寡糖Fig.4 Separation of linear β-1，3-glucooligosaccharides by fractional precipitation of methylene chloride or ethyl acetate

5倍體積氯仿可以較完全的沉淀熱凝膠水劑產物，可以用5倍體積氯仿沉淀熱凝膠水解產物的復溶液作為TLC分析的參照。由圖4分析可知對于10 g/L的熱凝膠水解液，2.0倍體積的二氯甲烷或2.2倍體積的乙酸乙酯可以充分沉淀大分子糖，補加2.7倍體積的二氯甲烷或1.2倍體積的乙酸乙酯后寡糖也得到了充分沉淀，進一步驗證了2.4探索的分級沉淀線性β-1，3-葡寡糖的體積。分級沉淀有兩個重要指標：一是有機溶劑的用量，二是沉淀的選擇性。兩種沉淀劑相比而言二氯甲烷使用體積較大，沉淀的選擇性更好；而乙酸乙酯的使用體積較小，沉淀的選擇性較差。二氯甲烷和乙酸乙酯分級沉淀各有優缺點，可以根據不同的需要選擇使用。

2.6 熱凝膠濃度對分級沉淀效果的影響

隨著熱凝膠濃度的升高，二氯甲烷和乙酸乙酯第一次沉淀中糖組成由原來的大分子糖逐漸變為大分子糖、寡糖和小分子糖，因此沉淀大分子糖所需的溶劑體積應越來越少；第二次沉淀復溶液中糖組成由原來的寡糖逐漸變為寡糖和小分子糖，因此沉淀寡糖所需的溶劑體積應越來越少。此外，熱凝膠濃度的升高會降低兩種有機溶劑分級沉淀的選擇性。更高熱凝膠濃度會增加水解產物相互碰撞的機會，有助于水解產物的凝集析出。

2.7 水解程度對分級沉淀效果的影響

隨著水解程度的升高，二氯甲烷和乙酸乙酯第一次沉淀、第二次沉淀和第二次沉淀上清中的寡糖組分并未發生明顯變化，因此水解程度的高低對二氯甲烷和乙酸乙酯分級沉淀沒有明顯影響。分級沉淀的原理是水解產物在混合體系中溶解度不同，同種聚合度水解產物的溶解度是不變的，因此水解程度對沉淀沒有影響。

圖5 熱凝膠濃度對分級沉淀效果的影響Fig.5 Influences on fractional precipitation of Curdlan concentration

圖6 水解程度對分級沉淀效果的影響Fig.6 Influences on fractional precipitation of degree of hydrolysis

2.8 水含量對分級沉淀效果的影響

圖7 水含量對分級沉淀效果的影響Fig.7 Influences on fractional precipitation of water content

隨著水含量的升高，二氯甲烷第一次沉淀的糖組分由大分子糖逐漸變為大分子糖和寡糖，而第二次沉淀的糖組分始終沒有明顯變化；乙酸乙酯第一次沉淀的糖組分始終沒有明顯變化，而第二次沉淀的糖組分由寡糖逐漸變為寡糖和小分子糖。因此隨著水含量的升高，二氯甲烷沉淀大分子糖所需體積越來越少，沉淀寡糖所需的體積沒有明顯變化；乙酸乙酯沉淀大分子糖所需體積沒有明顯變化，沉淀寡糖所需體積越來越少。由圖7可知，與熱凝膠濃度一樣，水含量的升高也會降低兩種有機溶劑分級沉淀的選擇性。

2.9 離子強度對分級沉淀效果的影響

圖8 離子強度對分級沉淀效果的影響Fig.8 Influences on fractional precipitation of ionic intensity

隨著離子強度的升高，二氯甲烷第一次沉淀中糖組成由原來的大分子糖逐漸變為大分子糖、寡糖，第二次沉淀復溶液中糖組成由原來的寡糖逐漸變為寡糖和小分子糖；乙酸乙酯第一次沉淀中糖組成由原來的大分子糖逐漸變為大分子糖、寡糖和小分子糖；第二次沉淀復溶液中糖組成由原來的寡糖逐漸變為小分子糖。因此二氯甲烷、乙酸乙酯沉淀大分子糖和寡糖所需體積都越來越少。水解結束時水解液中含有鹽酸可以不必中和而直接利用有機溶劑沉淀，一是較高的離子強度減少了有機溶劑的使用體積，二是能夠避免鹽分對水解產物的吸附。由圖8可知，與熱凝膠濃度和水含量一樣，離子強度的升高也會降低兩種有機溶劑分級沉淀的選擇性。

3 結論

甲醇、乙醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酰丙酮、苯、乙酸乙酯等九種常見的有機溶劑可以沉淀分離二甲亞砜中的熱凝膠水解產物，其中二氯甲烷和乙酸乙酯有較高的應用可行性。二氯甲烷和乙酸乙酯沉淀10 g/L熱凝膠水解液中大分子糖的用量分別為2.0倍體積和2.2倍體積，沉淀生寡糖的用量分別為4.7倍體積和3.4倍體積，且二氯甲烷的沉淀選擇性高于乙酸乙酯。二氯甲烷和乙酸乙酯分級沉淀效果受熱凝膠濃度、水含量和離子強度的影響，而不受水解程度的影響。盡管提高水解液中的含水量和離子強度可以減少有機溶劑的用量，但較高熱凝膠濃度下提高水解液的含水量和離子強度沒有必要，一是降低了沉淀的選擇性，二是增加了后處理的難度和費用。分級沉淀后水解催化劑HCl可添加NaOH進行中和，并能方便地過濾或離心除去NaCl沉淀。由于常壓下二甲亞砜與二氯甲烷和乙酸乙酯的沸點相差很大，因此可采用簡單蒸餾分離回收二氯甲烷、乙酸乙酯和二甲亞砜。

綜上所述，有機溶劑分級沉淀法不僅可以快速中止熱凝膠水解反應，而且克服了中和法難以分離二甲亞砜與水解產物的難題。與層析分離和膜分離方法相比，有機溶劑分級沉淀分離生物活性β-1，3-葡寡糖快速高效、操作簡便、可行性較高，對線性β-1，3-葡寡糖的分離純化具有重要的指導意義。

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Separation of linear β-1，3-glucooligosaccharides by fractional precipitation of organic solvents

LU Guang-xing1，LUO Chen1，+，MAO Jiang-chuan1，YANG Han1，JIA Yun1，JIANG Qiao-shi1，ZHANG Hong-tao1，ZHAN Xiao-bei1，2，*，ZHU Li2
（1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Jiangsu Rayguang Biotech Co.，Ltd.，Wuxi 214125，China）

HClhydrolysis ofCurdlan in dimethylsulfoxide could massively prepare linearβ-1，3-glucooligosaccharides.Different kinds of organic solvents were selected to quickly and efficiently separate linear β-1，3-glucooligosaccharides from dimethyl sulfoxide by precipitation and fractional precipitation.Nine kinds of common organic solvents could precipitate Curdlan hydrolysis product，and high feasibility could be got by methylene chloride and ethyl acetate.Methylene chloride and ethyl acetate could be used to separate linear β-1，3-glucooligosaccharides by fractional precipitation and smaller volume but poor selectivity with ethyl acetate.Curdlan concentration，water content and ionic intensity had different influences on fractional precipitation，but degree of hydrolysis had no influence on fractional precipitation.Organic solvent fractional precipitation method could terminate Curdlan hydrolysis reaction and separate hydrolysis product efficiently and quickly.Moreover，it was conducive to recycle dimethyl sulfoxide and organic solvent.Therefore，this method had important guiding significance for separation and purification of β-1，3-glucooligosaccharides.

curdlan；linear β-1，3-glucooligosaccharide；dimethyl sulfoxide；organic solvent；fractional precipitation

TS245.9

B

1002-0306（2015）22-0256-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.045

2015-03-16 +為并列第一作者

陸光興（1990-），男，碩士研究生，研究方向：生物化工和功能性低聚糖，E-mail：misitelu@163.com。

羅宸（1993-），女，大學本科，研究方向：功能性低聚糖，E-mail：651928872@qq.com。

*通訊作者：詹曉北（1962-），男，博士，教授，研究方向：生物化工和功能性低聚糖，E-mail：xbzhan@yahoo.com。

國家級大學生創新創業訓練計劃；國家自然科學基金（31171640，31201384，31271888）；無錫市科技支撐計劃（CLE01N1208）；無錫市

生物農業領軍型創業人才計劃（“130”計劃）；無錫中小企業創新基金（CBE01G1344）。