響應面法優化黑豆納豆的制取工藝研究

劉 暢，江連洲，李小雅，孫樹坤，韓翠萍，*，江楊娟，趙 月，王 迪

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030）

響應面法優化黑豆納豆的制取工藝研究

劉 暢1，江連洲1，李小雅1，孫樹坤2，韓翠萍1，*，江楊娟1，趙 月1，王 迪1

（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.國家大豆工程技術研究中心，黑龍江哈爾濱150030）

針對納豆口味的不適宜性，以黑豆為原料，采用響應面分析法，以感官評價為響應值，研究黑豆納豆的發酵工藝。結果表明，得到的黑豆納豆發酵的最佳條件為：浸泡時間為19.5 h，發酵時間為23.5 h，接種量為4.5%。以此條件制作出的納豆呈灰黑色，有納豆香味，口感酥軟，得到黑豆納豆感官評分的平均值為8.57。因此選用黑豆作為原材料發酵成納豆，在未來市場中具有廣闊的發展前景。

黑豆納豆，發酵，制取工藝，響應面法分析

納豆是日本的傳統發酵食品，迄今已有2000多年的歷史[1]，與中國的豆豉有很深的淵源[2]。納豆是將大豆煮熟后，經納豆菌繁殖發酵后而形成的發酵食品[3]。納豆的制作工藝分傳統法和工業法兩種，傳統法依地區和配方不同而各有差異，工業法全國比較統一[4]。納豆中所含的納豆激酶（枯草桿菌蛋白酶）[5]、超氧化物歧化酶、異黃酮等多種生理活性物質具有很好的溶血栓、抗氧化等保健功能[6]，與傳統的溶栓劑相比，納豆激酶具有不易引起出血、無抗原性、半衰期長、安全無毒且成本低廉和能口服吸收、溶栓等優點，因而具有廣闊的開發前景，可能成為新一代的溶栓藥物[7]。

黑豆又名烏皮青仁豆或烏皮黃仁豆，為豆科植物大豆的黑色種子[8]，原產中國安徽[9]，其加工制作的產品暢銷歐美、日韓和東南亞等地區，且供不應求[10]。黑豆中不僅含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素、胡蘿卜素、微量元素和粗纖維等多種營養物質[11]，具有預防動脈血管硬化、骨質疏松、大腦老化等功能，其黑色種皮中還含有對人體有益的異黃酮類——大豆黃酮苷和花色苷等成分[12]。大豆黃酮苷里含有A、B、C、D、E 5個苷元，具有對人體有益的生理生化作用[13]。黑豆中的多糖成分還可以促進骨髓組織的生長，刺激造血功能的再生[14]。

黑豆是一種食藥兼備的物質，但是黑豆主要用于生產草藥和飼料，市面上在食品中的應用并不多[15]。本文在傳統納豆生產的基礎上做了一些技術調整，以具有降血脂、防衰老等諸多功能的黑豆為原料，采用響應面分析法，以感官評價為響應值，分別對黑豆的浸泡時間、納豆菌接種量、發酵溫度、發酵時間、后熟時間進行了探究。在此條件下制作的納豆營養價值將會更加豐富，更能較好地掩蓋傳統納豆的氨味，更加符合中國國情，適合中國居民。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮黑豆 山東省臨沂市老郭農家店；納豆芽孢桿菌 廣州市微元生物科技有限公司，有效活菌數≥200億/g；脫脂棉紗布 新鄉市大方醫療器械制造有限公司。

HZQ-F160全溫振蕩培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；SZ26H2不銹鋼鍋 浙江蘇泊爾股份有限公司；WK2102T電磁爐 佛山市順德區澳特萊斯電器有限公司；BS-180.4分析天平 上海卓精電子科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 加工工藝流程 選黑豆→清洗→浸泡→蒸煮→冷卻→接種→發酵→后熟→調味[16]。

1.2.2 加工工藝要點 在水溫25～28℃、水量3倍條件下浸泡，至黑豆發脹無褶皺。將浸泡好的黑豆放入不銹鋼鍋中蒸煮2 h左右，蒸煮后豆粒用手可直接捏軟即可。將蒸制好的黑豆冷卻至室溫，在清洗干凈的燒杯中用蒸出的豆汁溶解一定量的納豆菌，攪拌后，將豆汁倒入小噴壺內，均勻噴灑在冷卻的黑豆上，進行接種。接種后將黑豆均勻攤開在燒杯中，厚度不要超過4 cm，容器上面鋪上干凈白紗布，以維持濕度。接種后在一定溫度恒溫培養箱中培養一定時間，直至表面出現白膜且有拉絲為佳。將發酵好的納豆放入4℃冰箱中進行后熟處理[17-18]。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 浸泡時間對黑豆納豆制取工藝的影響 取30 g黑豆進行實驗，每組10 g，將黑豆分別浸泡12、16、20、24、28 h，蒸煮、冷卻后進行接種，接種量4%，接種后在33℃恒溫培養箱中發酵22 h，最后放入4℃冰箱后熟，時間為24 h，對產品進行感官評定，結果取平均值。

1.2.3.2 納豆菌接種量對納豆制取工藝的影響 取30 g黑豆進行實驗，每組10 g，將黑豆浸泡20 h，蒸煮、冷卻后進行接種，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%，接種后在33℃恒溫培養箱中發酵22 h，最后放入4℃冰箱后熟，時間為24 h，對產品進行感官評定，結果取平均值。

1.2.3.3 發酵溫度對納豆制取工藝的影響 取30 g黑豆進行實驗，每組10 g，將黑豆浸泡20 h，蒸煮、冷卻后進行接種，接種量4%，接種后分別在27、30、33、36、39℃的恒溫培養箱中發酵22 h，最后放入4℃冰箱后熟，時間為24 h，對產品進行感官評定，結果取平均值。

1.2.3.4 發酵時間對納豆制取工藝的影響 取30 g黑豆進行實驗，每組10 g，將黑豆浸泡20 h，蒸煮、冷卻后進行接種，接種量4%，接種后在33℃恒溫培養箱中分別發酵14、18、22、26、30 h，最后放入4℃冰箱后熟，時間為24 h，對產品進行感官評定，結果取平均值。

1.2.3.5 后熟時間對納豆制取工藝的影響 取30 g黑豆進行實驗，每組10 g，將黑豆浸泡20 h，蒸煮、冷卻后進行接種，接種量4%，接種后在33℃恒溫培養箱中發酵22 h，最后放入4℃冰箱中進行后熟，后熟時間分別為16、20、24、28、32 h，對產品進行感官評定，結果取平均值。

在進行電路設計時為了減少電源對信號的影響，在SIM-RST和SIM-CLK引腳兩端加入了100 pf的濾波電容以增強穩定性。同時為了節約空間，SIM卡槽設計在PCB板背面，既美觀大方，又減少布線的長度。

1.2.4 響應面法優化黑豆納豆制取工藝實驗 在考察了浸泡時間、納豆菌接種量、發酵溫度、發酵時間、后熟時間等單因素基礎上，通過Box-Behnken實驗設計法，選定浸泡時間、發酵時間、接種量3個因素作為目標變量，實驗因素及水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Experimental design of RSM

1.2.5 感官評價 在實驗室中對制取的新鮮納豆進行感官評價，由10名20～30歲的感官評價人員組成評價小組，其中男性成員5名，女性成員5名[19]。根據感官評價的標準和要求對評價小組進行適當的培訓。滿分為10分，感官評分標準見表2[20-21]。

1.2.6 數據處理 通過Origin7.5和Design-Expert 8.0、SPSS Statistics20.0對所得數據進行分析。

表2 感官評價表Table 2 The evaluation of sensory qualities

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 浸泡時間對納豆制取工藝的影響 由圖1可以看出，浸泡時間20 h與浸泡時間16、28 h差異顯著（p＜0.05），浸泡時間20 h與浸泡時間12 h差異顯著（p＜0.05），浸泡時間過短黑豆不能充分吸收水分，時間過長，細菌過度繁殖，納豆口味變差，浸泡時間在20～24 h時，感官評分趨于平穩，在20 h時達到最高值。

2.1.2 納豆菌接種量對納豆制取工藝的影響 實驗結果見圖2，納豆菌的接種量對納豆制取工藝的影響頗為顯著。在接種量為1%～3%之間，納豆感官評分呈顯著（p＜0.05）上升趨勢。在3%～5%之間，感官評分趨于平穩，在4%時達到最大值。這是因為低濃度時，納豆芽孢桿菌不能充分、完全的催化納豆進行發酵。濃度較高時，在一定量基質（納豆）的前提下，只有部分納豆芽孢桿菌能較完全的吸收利用黑豆中的營養物質，因而感官評分不會產生較大的變化。

圖1 浸泡時間對納豆制取工藝的影響Fig.1 Effect of soaking time on the preparation technology of natto

圖2 納豆菌接種量對納豆制取工藝的影響Fig.2 Effect of Bacillus natto inoculation on the preparation technology of natto

2.1.3 發酵溫度對納豆制取工藝的影響 由圖3可以看出，隨發酵溫度的升高，納豆感官評分呈現較明顯的先增大后減小的變化趨勢，在溫度33℃時達到最高。

圖3 發酵溫度對納豆制取工藝的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the preparation technology of natto

2.1.4 發酵時間對納豆制取工藝的影響 由圖4可知，納豆感官評分隨發酵時間的增加呈現先升高后下降的趨勢，這是由于隨著發酵時間的延長，納豆菌與納豆表面的接觸時間也隨之延長，因納豆芽孢桿菌是嗜氧菌，所以接觸空氣的時間越長，其吸收利用黑豆蛋白中的營養物質來繁殖絲氨酸蛋白酶（即納豆激酶）的時間就越長，發酵效果就越好。發酵前期，由于時間較短，納豆芽孢桿菌中的活性物質沒有完全釋放。而發酵后期，隨著時間延長，納豆芽孢桿菌中的另一些好氧細菌開始迅速繁殖，對其有效的活性成分的發揮造成了不良影響，所以評分呈下降趨勢[22]。

圖4 發酵時間對納豆制取工藝的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the preparation technology of natto

2.1.5 后熟時間對納豆制取工藝的影響 從圖5可以看出，后熟時間對納豆感官評分的影響并不明顯，呈現先上升后下降的趨勢，后熟時間24 h時感官評分達到最大值。

圖5 后熟時間對納豆制取工藝的影響Fig.5 Effect of after-ripening time on the preparation technology of natto

2.2 響應面法優化黑豆納豆制取工藝

2.2.1 分析因素選擇及分析方法 根據Box-Behnken實驗設計原理，采用三因素三水平響應面法確定黑豆納豆制取工藝，實驗設計及結果見表3。

2.2.2 模型建立及顯著性分析 利用Design-Expert 8.0軟件對表3中的數據進行多元回歸擬合分析，以感官評價得分為響應值（Y），各因素對響應值的響應模型為：

Y=8.18+0.39A+0.21B+0.50C-0.025AB-0.30AC+ 0.20BC-1.38A2-0.78B2-0.10C2

表3 響應面分析實驗設計及結果Table 3 Design and results of RSM

對該模型進行方差分析，結果見表4。由表4可知，響應面回歸模型極顯著（p＜0.0001）；模型失擬項不顯著（p=0.3939＞0.05），說明方程和實驗擬合較好。該方程的相關系數R2=0.9814，說明該模型能解釋98.1%的響應值變化，即該模型與實際實驗擬合程度良好，實驗誤差小。本實驗的CV（變異系數）為2.86%，說明其置信度較高，模型方程能較好地反應真實的實驗值。由表4還可知，在總因素中，一次項A、C以及二次項A2、B2項對納豆感官評分影響極顯著（p＜0.01），一次項B以及二次項AC對感官評分影響顯著（p＜0.05）。由F值可知，各單因素對納豆感官評分的影響次序為納豆菌接種量＞浸泡時間＞發酵時間；各兩因素間交互作用影響次序為發酵時間和接種量＞浸泡時間和接種量＞浸泡時間和發酵時間。

表4 響應面方差分析Table 4 Analysis of variance of RSM

圖6 浸泡時間和發酵時間交互作用對納豆感官評分影響的響應面圖Fig.6 Response surface plot of Effect of soaking time and fermentation time as well as their mutual interactions on natto sensory score

圖7 浸泡時間和接種量交互作用對納豆感官評分影響的響應面圖Fig.7 Response surface plot of Effect of soaking time and Bacillus natto inoculation as well as their mutual interactions on natto sensory score

2.2.3 響應面分析與優化 根據回歸方程，可作出響應面圖，直觀反映了浸泡時間、發酵時間、接種量及其交互對響應值的影響。由圖6～圖8可以看出，浸泡時間與接種量的交互作用對納豆感官評分的影響顯著，響應面表現為曲線較陡。浸泡時間過短或過長，原材料沒有經過恰當的預處理，使黑豆不能與納豆芽孢桿菌充分反應；隨著接種量的增加，微生物生長繁殖加快，運動加快，代謝增強，充分吸收、利用了黑豆中的多種營養物質，使黑豆能夠更好的進行發酵，從而納豆感官評分逐漸升高。浸泡時間與接種量、浸泡時間與發酵時間的交互作用不顯著。通過軟件分析，黑豆納豆的感官評分最優參數為浸泡時間19.46 h，發酵時間23.43 h，接種量為4.55%，在此條件下黑豆納豆感官評分最高為8.59。

圖8 發酵時間和接種量交互作用對納豆感官評分影響的響應面圖Fig.8 Response surface plot of Effect of fermentation time and Bacillus natto inoculation as well as their mutual interactions on natto sensory score

2.2.4 回歸模型的驗證實驗 為檢驗所得結果的可靠性，采用上述優化條件進行驗證實驗，考慮操作的方便性，制取條件修正為：浸泡時間為19.5 h，發酵時間為23.5 h，接種量為4.5%，重復三次，得到黑豆納豆感官評分的平均值為8.57，與預測值接近，由此可見利用響應值分析法確立黑豆納豆的最佳制取工藝是可行的。

3 結論

本研究應用響應面分析方法，參照傳統納豆生產工藝，開發并優化了黑豆納豆的制取工藝。在單因素實驗的基礎上，得出黑豆納豆的最佳制取工藝為：浸泡時間為19.5 h，發酵時間為23.5 h，接種量為4.5%，在此條件下制作出的納豆呈灰黑色，有納豆香味，口感酥軟，黑豆納豆的感官評分為8.57，與響應面法設計的實驗預測值8.59差異不顯著，驗證了實驗模型的可行性，故所得黑豆納豆制取工藝條件切實可行，具有實際應用價值。

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Optimization of preparation technology of natto from black soybean by response surface methodology

LIU Chang1，JIANG Lian-zhou1，LI Xiao-ya1，SUN Shu-kun2，HAN Cui-ping1，*，JIANG Yang-juan1，ZHAO Yue1，WANG Di1
（1.College of Food Science，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China；2.National Soybean Engineering Technology Research Center，Harbin 150030，China）

For getting the suitability of natto flavor，black soybean was took as raw material，using response surface analysis method，the sensory evaluation was used as response value.Studying the fermentation technology of black soybean natto.The results showed the optimal fermentation conditions were as follows：soaking time 19.5 h，the fermentation time 23.5 h，inoculation 4.5%.Under the optimal conditions，natto was gray black，with natto smelled，soft.Therefore took black soybeans as raw material to make natto by fermentation had a broad development prospect in the future market.

black soybean natto；fermentation；processing technology；response surface methodology

TS214.2

B

1002-0306（2015）22-0262-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.046

2015－03－19

劉暢（1990-），女，碩士研究生，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：15945166865@163.com。

*通訊作者：韓翠萍（1974-），女，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：cphan2006@126.com。

國家科技支撐計劃項目（2014BAD22B01）。