響應面法優化冷鮮雞復合生物保鮮劑配比

高 磊，謝 晶，葉 藻，張新林，高忱岳陽，汪逸麟

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

食品添加劑

響應面法優化冷鮮雞復合生物保鮮劑配比

高 磊，謝 晶*，葉 藻，張新林，高忱岳陽，汪逸麟

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

為了延長冷鮮雞的貨架期，在單因素實驗的基礎上，利用Box-Behnken實驗設計和響應面法研究了由牛至精油、茶多酚和D-異抗壞血酸鈉配制的復合保鮮劑對冷鮮雞胸肉的保鮮效果。建立了以揮發性鹽基氮（TVB-N）含量為響應值的二次回歸模型，確定了復合生物保鮮劑中各種組分的最佳配比。將優化的復合生物保鮮劑應用于雞肉保鮮，通過測定感官評定、質構、色差、pH、菌落總數、TVB-N以及硫代巴比妥酸（TBA）值等指標，對其保鮮效果進行了驗證。結果表明：三種生物保鮮劑的最佳添加量為牛至精油0.786%、茶多酚0.164%和D-異抗壞血酸鈉0.031%，此時TVB-N可達81.89 mg/100 g。經復合保鮮劑處理過的冷鮮雞胸肉在4℃下貯藏時，可將貨架期由常規冷藏對照組的7 d延長至11～12 d。

冷鮮雞，響應面法，復合生物保鮮劑，牛至精油，茶多酚，D-異抗壞血酸鈉

雞肉以肉質細嫩、滋味鮮美等特點受廣大消費者的青睞，它含有豐富的營養物質和多不飽和脂肪酸[1]，容易腐敗變質，限制其貨架期。同時，動物性流感H7N9的爆發[2]使得冷鮮雞的市場需求不斷增加。因此，研究冷鮮雞的保鮮技術具有重要的社會價值和指導意義。隨著人們的食品安全意識日益加強，生物保鮮劑因具有安全、無毒等特點，更易被廣大消費者所接受。牛至精油具有極強的抑菌作用，同時還能延緩脂肪氧化，可有效地延長食品貨架期[3]；茶多酚具有極強的清除自由基作用，成為食品重要的抗氧化劑[4]；D-異抗壞血酸鈉是食品中非常重要的抗氧化劑，也是肉制品加工過程中常用的發色助劑和護色劑，可改善食品的感官品質[5]。根據柵欄技術的原理[6]：綜合利用每個柵欄因子間的協同作用，復合保鮮劑往往會產生較單一生物保鮮劑更好的保鮮作用[7]。Khanjari等[8]將雞肉浸泡在由1 g/100 mL N，O-羧甲基殼聚糖與1%牛至精油組成的復合保鮮劑后于4℃貯藏，結果表明，貨架期較對照組相比延長了5 d；張立彥等[9]將雞肉先經濃度8 mg/L臭氧浸泡清洗20 min，隨后浸涂含1.5%殼聚糖、0.3%茶多酚及0.5%VC的復合保鮮劑后于4℃貯藏，使貨架期延長至28 d。

響應曲面法是一種集數學和統計學方法于一體的優化法，它能精確、有效地確定各因素間的最佳條件，近年來常應用于解決多變量的問題[10-11]，而目前利用響應面法對冷鮮雞復合保鮮劑進行復配優化的研究相對較少。同時，揮發性鹽基氮含量較菌落總數更能直接地反映冷鮮肉的腐敗變質情況[12]。因此，本研究選用牛至精油、茶多酚和D-異抗壞血酸鈉配制成復合生物保鮮劑。在單因素實驗的基礎上，將TVB-N含量作為響應值，采用Box-Behnken實驗設計與響應面分析對其進行配比優化，并通過測定感官評分、菌落總數以及理化指標對其保鮮效果進行驗證，旨在為冷鮮雞的保鮮技術提供一定的參考，推動雞肉產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷鮮雞胸肉 購于上海臨港農工商超市（臨港新城店）冷鮮肉專柜，均為當天出廠的新鮮冷鮮雞，利用冰袋保藏，0.5 h內送到實驗室，取其胸肉以作樣品；100%純天然牛至精油 美國多特瑞公司；茶多酚（食品級，多酚含量≥98%） 陜西普維生物制品有限公司；D-異抗壞血酸鈉（食品級） 鄭州啟源食品添加劑有限公司；營養瓊脂培養基 青島高科技工業園海博生物技術有限公司；乙醇、氯化鈉、輕質氧化鎂、硼酸、鹽酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、溴甲酚綠、甲基紅（均為分析純） 國藥集團化學試劑北京有限公司。

TA.XT plus質構儀 英國Stable Micro System公司；Kjeltec8400全自動凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；PB-10C標準型pH計 德國賽多利斯公司；CHROMA METER CR-400色差計 日本KONICA MINOLTA公司；LDZX-50KE高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；VS-1300L-U潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；Ymnl-9D無菌均質器 南京以馬內利儀器設備有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；BCD-252MHV冰箱 蘇州三星電子；SJH-4S數控精密恒溫水浴鍋 寧波天恒儀器廠；UV-3000 PC紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；H2050R-1高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 將新鮮的冷鮮雞去頭去腳后用溫水洗凈，在無菌操作下，分割成大小均勻的肉塊（約10 g），隨機分成14組（每組8塊）。將牛至精油溶解于含20%乙醇的蒸餾水中，然后依次加入茶多酚和D-異抗壞血酸鈉，使其充分溶解，制成復合保鮮劑。最后將雞肉浸漬在配好的復合保鮮劑溶液中2 min，取出于室溫瀝干后，將其分裝到無菌自封袋中于4℃冰箱中保藏。

1.2.2 響應面實驗設計 在預實驗的基礎上，利用Box-Behnken采用三因素三水平的響應面分析方法設計實驗。將牛至精油、茶多酚和D-異抗壞血酸鈉保鮮劑的添加量作為響應變量，以第0、2、4、6、8、10、12 d肉樣中揮發性鹽基氮含量的總和（通過預實驗已確定貯藏期在10～12 d）作為響應值，通過響應面分析對該復合生物保鮮劑的最佳添加量進行優化，并與不添加保鮮劑處理的對照組進行比較驗證，實驗因素水平設置見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factors and levels used in RSM design

1.2.3 指標測定

1.2.3.1 感官評定 根據GB 2707-2005《鮮（凍）肉衛生標準》[13]，由5名受過專業培訓的感官評定人員按評分表[14]對肉樣進行感官評價。把各項評分相加，總分≥40分的為一級鮮度，30～39分的為二級鮮度，20～29分的為三級鮮度，20分以下的為變質品，評定標準見表2。

表2 雞肉感官評分標準Table 2 Sensory evaluation criteria for chilled chicken

1.2.3.2 質構的測定 將肉樣用無菌手術刀分割成形狀均勻的肉塊（2 cm×2 cm×1 cm），每組測定6塊，選取彈性、咀嚼性和回復性等指標進行研究。測試參數[15]：測試模式：TPA；探頭：P/5圓柱形不銹鋼探頭；測試速率：1 mm/s；測試距離：5 cm；循環次數：2次；間隔時間：5 s。

1.2.3.3 色差的測定 用手持式色差計分別對固定位置進行色差測試。

1.2.3.4 pH的測定 準確稱取樣品5 g置于燒杯，加入45 mL蒸餾水，攪勻靜置30 min后，用pH計進行測定。

1.2.3.5 菌落總數（aerobic plate count，APC）的測定參照GB/T 4789.2-2010《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》[16]，采用平板傾注法計數測定，結果以菌落總數的對數表示。

早在2013年中國啤酒產量達到歷史高點的5061.5萬升后，就進入明顯的下降通道。2014年至2017年產量分別為：4921.8萬千升、4715.7萬千升、4506.4萬千升和4401.5萬千升，同比數據均明顯下滑，分別為：-2.8%、-4.2%、-4.44%和-2.33%。才府玻璃主要客戶華潤雪花雖然位居中國啤酒榜首，但同樣疲態盡顯。

1.2.3.6 TVB-N的測定 參照GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛生標準的分析方法》，采用半微量定氮法[17]。

1.2.3.7 硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值的測定 參考Ali等[18]的方法進行測定。

1.3 數據處理方法

實驗均做3次平行，數據以“平均值±標準差”（x± s）表示，利用SPSS 19.0進行差異顯著性分析（p＜0.05表示顯著差異），采用Duncans法進行多重比較；采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應曲面圖和等高線圖的繪制；曲線采用OriginPro 9.0繪制。

2 結果與分析

2.1 Box-Behnken實驗結果

表3 復合生物保鮮劑濃度的響應面實驗方案與結果Table 3 The design and results of RSM of composite biological preservative

具體的響應面實驗方案與結果如表3所示，其中共15個實驗點，13～15是中心實驗點，用于估算實驗誤差。中心實驗平均值為（78.67±0.84）mg/100 g，誤差較小，符合實驗設計的要求。對實驗數據進行回歸擬合，得到TVB-N值對牛至精油、茶多酚和D-異抗壞血酸鈉3個因素的二次多項回歸方程為：

Y=78.67-2.67A+0.58B+2.11C+3.42AB-2.94AC-0.24BC+2.20A2+5.17B2+4.19C2

為了進一步驗證模型的可靠性，對回歸方程進行方差分析，結果見表4。總模型方程顯著（p＜0.05）；相關系數R2=92.91%，表明模型相關度好；變異系數（C.V.）=2.68%，數值較小，表明模型的可信度較高；失擬項p=0.1170＞0.05，表明模型與實驗結果擬合度高，該模型預測值與實際值能較好地吻合，適用于冷鮮雞品質變化的預測和分析。從表4可知，牛至精油和D-異抗壞血酸鈉兩個因素對冷鮮雞的TVB-N值均有顯著影響（p＜0.05），且AB、AC存在顯著的交互作用（p＜0.05）。

表4 響應面回歸模型的方差分析Table 4 The variance analysis of regression model

2.3 復合保鮮劑各用量的響應曲面分析

利用Design-expert 8.0.6軟件繪制模型的響應面圖，從而可以較直觀地反映各因素對響應值的影響程度。等高線的形狀可反映因素間交互作用的強弱，橢圓形表示兩個因素交互作用顯著，而圓形則表示不顯著[19]，結果見圖1～圖3。

圖1 牛至精油和茶多酚的交互作用對TVB-N含量的影響Fig.1 Effect of interaction between oregano essential oil and tea polyphenols on TVB-N value

圖2 牛至精油和D-異抗壞血酸鈉的交互作用對TVB-N含量的影響Fig.2 Effect of interaction between oregano essential oil and D-sodium erythorbate on TVB-N value

圖3 茶多酚和D-異抗壞血酸鈉的交互作用對TVB-N含量的影響Fig.3 Effect of interaction between tea polyphenols and D-sodium erythorbate on TVB-N value

圖1為A（牛至精油）和B（茶多酚）對揮發性鹽基氮含量的響應面圖。由圖1所示，當異抗壞血酸鈉取0水平時，牛至精油與茶多酚協同作用的等高線為橢圓形，表明AB對TVB-N值的影響顯著，兩者復合的保鮮劑能產生協同作用。

圖2為A（牛至精油）和C（異抗壞血酸鈉）對揮發性鹽基氮含量的響應面圖。由圖2所示，當茶多酚取0水平時，牛至精油與茶多酚協同作用的等高線為橢圓形，表明交互作用顯著，兩者復合的保鮮劑也能產生協同作用，這與報道的牛至精油與其他保鮮劑復合使用產生顯著的保鮮效果相吻合[20-21]。

圖3為B（茶多酚）和C（異抗壞血酸鈉）對揮發性鹽基氮含量的響應面圖。由圖3所示，當牛至精油取0水平時，茶多酚與異抗壞血酸鈉協同作用的等高線為圓形，交互作用不顯著，表明兩者復合的保鮮效果與單獨作用之和沒有顯著差異。但兩者作為食品行業中重要的抗氧化劑和肉制品加工過程中常用的發色助劑，將兩者結合能較好的保持食品的色澤和風味[5，22]，改善冷鮮雞經保鮮劑處理后感官的變化，對其保鮮具有重要作用。

以上結果與表4的分析結果相吻合，通過對回歸方程求導得到曲面的極點值：即TVB-N總和最小為77.39 mg/100 g，所對應的牛至精油含量為0.786%，茶多酚含量為0.164%，異抗壞血酸鈉含量為0.031%。在此基礎上進行驗證實驗，TVB-N達到81.89 mg/100 g，與理論值相差5.81%，兩值接近，此模型可用。

2.4 復合保鮮劑對冷鮮雞保鮮效果的驗證

2.4.1 感官評定 感官指標是評價冷鮮肉品質的重要指標之一，直接影響產品的銷售，根據制定的感官評定表，對肉樣進行感官評定，結果如表5所示。

表5 雞肉在4℃貯藏期間感官品質變化結果Table 5 Sensory evaluation scores of cold chicken breaststored at 4℃

由表5可知，冷鮮肉在貯藏期間，兩組的感官評分值都隨貯藏時間的延長而呈下降趨勢，且對照組的感官評分值下降速度明顯較快。第8 d對照組感官分值低于20分，為變質品，而處理組得分顯著高于對照組（p＜0.05），處于三級鮮度范圍，直到第12 d后才不可接受。由此可知，復合保鮮劑能夠有效地減緩冷鮮雞在貯藏期間綜合感官品質的劣變，從而延長其貨架期。

2.4.2 質構的變化 質構特性作為評價肉樣品質的重要指標，主要表征肉樣的結構、組織形態和口感等[23]。借助質構儀可以對食品的某些感官特性進行更精確和具體的分析，同時可以避免感官評價時因分析人員不同而造成的主觀誤差。

圖4反映了冷鮮雞在冷藏過程中彈性、咀嚼性和回復性的變化。隨著貯藏時間的延長，冷鮮雞的質構特性均有不同程度的降低，代表著雞肉從新鮮向腐敗發展的過程。其中，處理組的質構特性普遍高于對照組（除咀嚼性第2 d外），與感官評定結果相符。彈性從第4 d后，處理組顯著高于對照組（p＜0.05），處理組直到第12 d才降至0.64，略低于對照組第8 d的0.68。處理組的回復性顯著高于對照組（p＜0.05），直到第12 d對照組的回復性降至0.15還略高于第8 d對照組的值。由于微生物的作用導致肉中肌原纖維蛋白的變化是肌肉失去彈性和回復性的重要原因[24]，復合保鮮劑能在貯藏初期有效地降低微生物數量，延緩了肉樣的彈性和回復性發生不可逆的劣變。第4 d后處理組的咀嚼性顯著高于對照組（p＜0.05），到了貯藏末期，隨著水分的不斷遷移導致蛋白質脫水變性[25]，兩組的咀嚼性均降至70以下，表明肉樣已失去良好的咀嚼性。顯然，利用復合保鮮劑處理冷鮮雞能有效減少冷藏過程中其質構特性的劣變，保持良好的感官品質。

圖4 冷鮮雞在4℃貯藏期間雞肉彈性（a）、咀嚼性（b）和回復性（c）的變化結果Fig.4 Changes in springiness（a），chewiness（b）and resilience（c）of cold chicken breast stored at 4℃

2.4.3 色差與pH的變化 冷鮮雞在4℃貯藏期間，色差變化結果如表6、表7所示。L*代表的是亮度，經過8 d和12 d的貯藏，對照組和處理組的L*值都逐漸減小（p＜0.05），表明兩組肉樣表面經貯藏變得暗紅，這主要與肌肉蛋白質的分解有關[26]。其中，處理組的L*值在貯藏初期及末期始終高于對照組，這是由于雞肉浸漬在復合保鮮劑后，其表面的顏色會稍稍變白，亮度明顯增高。a*值代表的是肉的紅度，對照組的變化范圍是3.84～5.96，處理組的是2.80～5.32。一般來說，a*值的變化僅對于色澤鮮紅的肉（如豬肉）是比較明顯的，因此，貯藏期間兩組雞肉a*值的變化無規律，同樣的現象發生在b*值中，這些結果與Latou等[27]所發現的結果相似。

如表6、表7所示，對照組和處理組樣品的pH在4℃貯藏期間呈總體上升的趨勢。兩組pH變化均顯著（p＜0.05），其中對照組上升較快，而處理組上升較為平緩。在貯藏初期pH有下降的過程，這主要與肉中含氮物質量的增加有關。屠宰后的雞肉，因無氧酵解的進行分解出乳酸和磷酸，從而導致pH的降低[28]。隨著貯藏時間的增加，對照組pH在第8 d已經達到6.75，肉品出現變質現象。這是由于蛋白質被蛋白酶降解成多肽和氨基酸，并釋放出堿性基團，使得pH上升。而處理組pH直到第12 d才超過6.70，可能是因為經復合保鮮劑處理，降低了微生物的數量，蛋白質分解產生的堿性物質以及胺類含量較低，因此該組的pH上升較緩慢。可見，復合生物保鮮劑能夠有效延緩雞胸肉在4℃貯藏過程中pH的升高。

表6 對照組組樣品在4℃貯藏期間的色差（L*，a*and b*）和pH變化結果Table 6 Changes in color（L*，a*and b*）and pH of cold chicken breast of treatment group stored at 4℃

表7 處理組樣品在4℃貯藏期間的色差（L*，a*and b*）和pH變化結果Table 7 Changes in colo（rL*，a*and b*）and pH of cold chicken breast of control group stored at 4℃

2.4.4 APC的變化 兩組樣品在4℃貯藏期間菌落總數變化如圖5所示。隨著貯藏時間的延長，兩組樣品的菌落總數隨之增長，且對照組的增長速率較為快速。由于復合保鮮劑中含有少量的乙醇，因此在第0 d時處理組的菌落總數稍低于對照組。在整個貯藏期間，處理組的菌落總數均顯著低于對照組（p＜0.05）。對照組在第8 d菌落總數超出限量標準108CFU/g，為8.30 lg（CFU/g），已屬腐敗肉[29]。而處理組直到第12 d才接近限量標準，為7.98 lg（CFU/g）。處理組的菌落總數的增長在第2～8 d較為平緩，這是由于貯藏初期微生物的數量較少，使牛至精油抑菌作用難以明顯表現出來，后來隨著微生物數量的增長，牛至精油的抑菌作用才得到顯現。可見，復合保鮮劑對冷鮮雞在4℃貯藏期間細菌的抑制作用顯著。

圖5 冷鮮雞在4℃貯藏期間APC的變化結果Fig.5 Changes in APC of cold chicken breast of control and treatment group stored at 4℃

2.4.5 TVB-N含量的變化 圖6所示，對照組在4℃貯藏過程中TVB-N值上升較快，在第8 d時TVB-N值已高達21.97 mg/100 g，超過限量20 mg/100 g，即肉樣已腐敗變質[17]。經復合保鮮劑處理過的肉樣TVBN值在貯藏初期上升速度平緩，第6 d后，由于微生物的大量繁殖導致蛋白質的分解出鹽基氮類物質，TVB-N值急劇升高，到第12 d才超過限量，達到20.67 mg/100 g。由此可見，該復合保鮮劑可以明顯抑制微生物的繁殖，從而有效延長了冷鮮雞的貨架期。揮發性鹽基氮的變化與肉樣中蛋白質含量變化以及pH的變化緊密相關，TVB-N值急劇上升，這與pH變化相一致。經過12 d的貯藏時間，冷鮮雞的TVB-N含量總和為81.89 mg/100 g。

圖6 冷鮮雞在4℃貯藏期間TVB-N含量的變化結果Fig.6 Changes in TVB-N of cold chicken breast of control and treatment group stored at 4℃

2.4.6 TBA值的變化 TBA值是油脂中不飽和脂肪酸氧化分解所產生的衍生物（如丙二醛等）與TBA反應的結果，TBA值越大氧化程度越高[30]，冷鮮雞4℃貯藏期間TBA值的變化見圖7。由圖7可以看出，隨著貯藏時間延長，兩組樣品TBA值逐漸增大，但經復合保鮮劑處理過的樣品的TBA值增長較對照組緩慢。從第2 d開始，處理組TBA值顯著低于對照組（p＜0.05），在第8 d時對照組TBA值為0.69 mg/100 g，而處理組直到第12 d TBA值才達0.64 mg/100 g。可見復合保鮮劑處理能有效延緩冷鮮雞脂肪氧化的速率（p＜0.05），這主要是由于復合保鮮劑中含天然抗氧化劑、自由基清除劑，能與脂肪酸自由基結合，減緩自由基連鎖反應，從而抑制脂肪自動氧化。

圖7 冷鮮雞在4℃貯藏期間TBA值的變化結果Fig.7 Changes in TVB-N value of cold chicken breast ofcontrol and treatment group stored at 4℃

3 結論

3.1 利用牛至精油、茶多酚以及D-異抗壞血酸鈉不同的保鮮效果，配制成復合生物保鮮劑。采用Box-Behnken實驗設計與響應面分析，確定該復合生物保鮮劑中各種組分的最佳添加比例為牛至精油0.786%、茶多酚0.164%和D-異抗壞血酸鈉0.031%，此時TVB-N達81.89 mg/100 g。

3.2 將復合生物保鮮劑應用于冷鮮雞肉保鮮，能有效延緩雞肉感官品質的劣變，直到第12 d才達到不可接受范圍；pH、菌落總數、TVB-N含量以及TBA值等指標均優于對照組。該復合保鮮劑能夠顯著延緩冷鮮雞的腐敗變質，在4℃貯藏條件下可將貨架期由對照組的7 d延長至11～12 d。

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Optimization of complex biological preservatives to improve preservation of chilled chicken by response surface methodology

GAO Lei，XIE Jing*，YE Zao，ZHANG Xin-lin，GAO Chen-yue-yang，WANG Yi-lin
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In order to extend the shelf life of chilled chicken，based on single factor experiment results，preservation effects of complex preservatives composed of oregano essential oil，tea polyphenol and D-sodium erythorbate on chilled chicken breast were studied by Box-Behnken experimental design and response surface methodology. Regarding TVB-N（total volatile basis nitrogen）as response value，Design-Expert software was used to construct quadratic regression model，so that the most appropriate ration of each kind of bio-preservative was identified.Chilled chicken breasts were treated with optimized complex biological preservative.Sensory valuation，textural analysis，color，pH value，APC（aerobic plate count），TVB-N and TBA（thiobarbituric acid）were determined to verify the effects of preservation.The results showed that the optimal rations of complex biological preservatives on chilled chicken were that oregano essential oil was 0.786%，tea polyphenol was 0.164%and D-sodium erythorbate was 0.031%，the TVB-N reached to 81.89 mg/100 g.The shelf life of chilled chicken treated by complex preservative was extended to 11～12 days compared to 7 days for the control group stored under 4℃.

chilled chicken；response surface methodology；complex biological preservative；oregano essential oil；tea polyphenols；D-sodium erythorbate

TS251.5

A

1002-0306（2015）22-0313-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.056

2015-03-09

高磊（1991-），男，碩士研究生，研究方向：食品保鮮，E-mail：leogaosh@163.com。

*通訊作者：謝晶（1968-），女，博士，教授，研究方向：食品物流，E-mail：jxie@shou.edu.cn。

2014年度國家星火計劃資助項目（2014GA680003）。