UHPLC-Q-TOF/MS分析黑順片的化學成分*

★ 徐鳳蓮 張啟云 彭國梅 姚蓉 李冰濤 徐國良 (江西中醫藥大學中醫基礎理論分化發展研究中心 南昌330004)

附子為毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeliDebx.)的子根的加工品。性大熱，味辛;入心經、脾經、腎經;具有回陽救逆、補火助陽，散寒除濕之功效等［1］。臨床用于治療陰盛格陽，大汗亡陽，風寒濕痹等疾病。附子屬于毒性藥材，臨床常用其炮制品，炮制過程中雙酯型生物堿水解成單酯型生物堿，毒性顯著降低等［2］。

目前，國內外對附子成分的研究已相當的成熟，但是全面解析黑順片化學成分的研究鮮有報道。本試驗采用UHPLC-Q-TOF/MS技術對黑順片的化學成分進行全面的分析。該技術結合了超高效超高效液相的高分離度和四級桿串聯飛行時間質譜的高分辨率、高靈敏度。UHPLC能為復雜的樣品提供快速有效的色譜分離;Q-TOF/MS提供精確的分子量和同位素峰度等相關信息，擬合出最適元素組成(誤差控制在5ppm以內)，結合二級質譜裂解碎片信息，比對相關數據庫和文獻，推測其可能的結構，確定峰歸屬。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1290系列超高效液相色譜儀(Agilent)，6538A四級桿飛行時間串聯質譜儀(Agilent)，Milli-Q Advantage A10(Millipore);旋轉蒸發儀(廈門精藝興業科技有限公司);KDM型調溫電熱套(鄄城華魯電熱儀器有限公司)。

1.2 試藥 本實驗所用標準品均來自四川省維克奇生物科技有限公司:烏頭堿標準品(批號:130723)，新烏頭堿標準品(批號:130402)，次烏頭堿標準品(批號:130509)，苯甲酰烏頭堿標準品(批號:130316)，苯甲酰新烏頭堿標準品(批號:130505)，苯甲酰次烏頭堿標準品(批號:130401)，黑順片(原產地四川;產品批號:1201001);甲醇(色譜純，Tedia);乙腈(色譜準，Tedia);甲酸(色譜純，Sigma);水為超純水。

2 試驗方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 混標溶液的制備 分別稱取烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿對照品約5mg，精密稱定，加甲醇定容到10mL容量瓶中，作為混標溶液儲備液。將上述儲備液稀釋100倍，即得混標溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 黑順片500g，置1000mL圓底燒瓶中，加入8倍量(m/v)水回流提取3次，每次1.5h，提取液濃縮至每1mL相當于2g黑順片原藥材。將上述的黑順片提取液用純水稀釋50倍，即得黑順片供試品溶液。

2.2 液質聯用條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Poroshell 120 EC-C18柱(3.0mm×100mm，2.7μm);柱溫:30℃;流動相A:0.1%甲酸水溶液，流動相B:乙腈，梯度洗脫程序為0～4min，5%B;4～6min，5%～8%B;6～15min，8%～18%B;15～20min，18%～26%B;20～28 min，26%～45%B;28～35min，45%～95%B;流速:0.4mL/min;進樣量:2μL。

表1 黑順片水提液中各成分MS2碎片的相關信息

注:S經標準品驗證。

2.2.2 質譜條件 正離子掃描;掃描范圍:100～1000Da;離子源:雙電噴霧離子源;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流速:10L/min;噴霧室壓力:40psig;毛細管電壓:4 000V;毛細管出口電壓:120V;錐孔電壓:65V。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續進樣6次，每次進樣2μL，計算五個主要色譜峰面積的RSD值，分別為2.91%、2.92%、1.23%、2.41%、1.50 %。

2.3.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0，4，8，12，24h進樣檢測，每次進樣2μL，計算五個主要色譜峰面積的RSD值分別為3.43%、3.41%、1.78%、4.05%、0.97%。結果表明樣品在24 h內穩定性良好。

2.3.3 重現性試驗 黑順片水提液按照"2.1"項目下稀釋方法平行6個樣本，依次進樣，每次進樣2μL，計算五個主要色譜峰面積的RSD值，分別為1.51%、2.07%、1.88%、1.53%、1.44%。表明，方法的重復性較好。

3 結果與討論

3.1 黑順片成分的快速鑒定 黑順片中生物堿類成分在Duel ESI正離子模式下獲得了良好的響應，其總離子流圖見圖1，在35 min內各個成分得到良好的分離。本實驗采用Masshunter工作站分析處理數據，對比PCDL數據庫、Chemspider等網站和相關文獻，鑒定了黑順片中70種成分，包括雙酯型生物堿(DDAs)4種，單酯型生物堿(MDAs)22種，醇胺型生物堿(ADAs)23種，脂型生物堿(LDAs)4種，其他類型17種(見表1)。

圖1 黑順片提取液總離子流圖

3.2 確認峰歸屬 C19-二萜類生物堿根據C-8和C-14位取代基的不同主要分為雙酯型生物堿、單酯型生物堿、醇胺型生物堿和脂型生物堿。

P64的一級質譜數據表明［M+H］+為m/z 616.311 0，Masshunter工作站擬合其化學組成為C33H45NO10，誤差為-0.81 ppm，初步推斷P64為次烏頭堿(Hypaconitine，HAC)。二級圖譜中碎片離子有m/z 584.289 5［MH-CH3OH?+，m/z 556.289 5［MH-CH3COOH］+，m/z 524.263 6［MHCH3COOH-CH3OH］+，m/z 496.267 8［MHCH3COOH-CH3OH-CO］+，m/z 492.237 0［MHCH3COOH-2CH3OH］+，m/z 464.242 2［MHCH3COOH-2CH3OH-CO］+，m/z 460.210 8［MH-CH3COOH-3CH3OH］+，m/z 432.217 0［MHCH3COOH-3CH3OH-CO］+，m/z 402.226 9［MH-CH3COOH-CH3OH-BzOH］+，m/z 370.200 5［MH-CH3COOH-2CH3OH-BzOH］+，m/z 338.174 6［MH-CH3COOH-3CH3OH-BzOH］+，其裂解途徑見圖2。參照標準品及相關數據庫和文獻等［5-6］鑒定該化合物為HA。

圖2 次烏頭堿裂解途徑

圖3 Benzoylmesaconitine和Circinasine B結構式

圖4 苯甲酰新烏頭堿裂解途徑

LDAs和DDAs的區別在C-8位取代基不同，前者為脂肪酰基取代，后者為乙酰基取代。因此，其裂解規律類似等［3-4］。同理，共鑒定出4個DDAs型和4個LDAs型化合物。

P42的一級質譜數據表明［M+H］+為m/z 590.295 9，Masshunter工作站擬合其化學組成為C31H43NO10，誤差為-0.17 ppm，初步推斷P42為苯甲酰新烏頭原堿或Circinasine B(見圖3)。二級圖譜中碎片離子有m/z 572.284 6［MH-H2O］+，m/z 558.269 3［MH-CH3OH］+，m/z 540.259 0［MHCH3OH- H2O］+，m/z 526.243 0［MH -2CH3OH］+，m/z 508.232 5［MH-2CH3OHH2O］+，m/z 494.216 6［MH-3CH3OH］+，m/z 476.206 1［MH-3CH3OH-H2O］+，其裂解途徑見圖4。參照標準品及相關數據庫鑒定該化合物為BMA。同理，共鑒定出22個MDAs型化合物。

圖5 Fuziline、Delcosine和Potanine結構式

圖6 附子靈裂解途徑

P20的一級質譜數據表明［M+H］+為m/z 454.279 8，Masshunter工作站擬合其化學組成為C24H39NO7，誤差為0.66 ppm，初步推斷P20為Fuziline/Delcosine/Potanine(見圖5)。二級圖譜中碎片離子有m/z 436.269 4［MH-H2O］+，m/z 418.257 9［MH-2H2O］+，m/z 404.243 4［MH-CH3OHH2O］+，m/z 386.231 9［MH-CH3OH-2H2O］+，m/z 376.211 5［MH-CH3OH-H2O-C2H4］+，m/z 372.216 8［MH-2CH3OH-H2O］+，m/z 358.201 0［MH-3CH3OH］+，m/z 354.205 1［MH-2CH3OH-2H2O?+，m/z 344.185 2［MH-2CH3OH-H2O-C2H4］+，其裂解途徑見圖6。參照相關數據庫和文獻［5］鑒定該化合物為Fuziline。同理，可鑒定出ADAs型化合物23個。

4 結論

本實驗運用UHPLC-Q-TOF-MS技術全面解析黑順片中生物堿類化學成分，初步鑒定出黑順片提取液中70個化合物。此外，在全掃描模式中檢測到了烏頭堿和新烏頭堿，由于含量少，并未打出二級質譜圖。通過對照品對比，RT與m/z均一致，故初步推測黑順片藥材中存在極微量的烏頭堿和新烏頭堿。本實驗較全面的解析了黑順片的化學成分，豐富了對黑順片中化學物質的認識，為黑順片藥效物質研究奠定基礎。

［1］中華人民共和國藥典委員會.中國藥典·一部［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010.

［2］郭志勇，呂永磊，許曉嘉，等.炮制對烏頭各部位水煎液中生物堿的影響［J］.中華中醫藥學刊，2014，32(08):1 867-1 870.

［3］Wang Y，Shi L，Song F，et al.Exploring the ester-exchange reactions of diester-diterpenoid alkaloids in the aconite decoction process by electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2003，17(4):279-284.

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［5］Hu R，Zhao J，Qi L，et al.Structural characterization and identification of C19-and C20-diterpenoid alkaloids in roots ofAconitum carmichaeliby rapid-resolution liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2009，23(11):1 619-1 635.

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