復方金鈴四逆四物失笑散對小鼠急性毒性實驗研究

白春霞，孫國娟，謝 萍*，馮 儉*，蔣 川，李 倩，崔靜怡

(1. 成都中醫藥大學，四川 成都 610032；2.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610032)

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復方金鈴四逆四物失笑散對小鼠急性毒性實驗研究

白春霞1，孫國娟2，謝 萍2*，馮 儉2*，蔣 川1，李 倩1，崔靜怡1

(1. 成都中醫藥大學，四川 成都 610032；2.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610032)

目的：研究復方金鈴四逆四物失笑散對小鼠的急性毒性，為臨床安全用藥提供科學依據。方法：小鼠單次灌胃給藥進行急性毒性預實驗，確定半數致死劑量(LD50)。采用24 h內以藥液最大濃度和最大給藥容積灌胃小鼠3次，連續14天觀察受試藥物對小鼠指標影響，測定最大給藥量。結果：小鼠1 天內最大給藥量為192g(生藥)/kg，相當于成人臨床推薦日用量的217.4倍。結論：復方金鈴四逆四物失笑散對小鼠無明顯毒性反應，臨床常用劑量安全性高。

復方金鈴四逆四物失笑散；KM小鼠；半數致死劑量；最大給藥量

復方金鈴四逆四物失笑散(以下簡稱復方失笑散)為我院名老中醫針對原發性痛經實證病機“不通則痛”，在古方基礎上加減而得，處方主要由延胡索、白芍、枳殼、當歸、五靈脂等藥材組成，具有理氣活血、化瘀止痛之效。此方臨床應用已有數十年，療效確切，在長期臨床應用中尚未發現毒性和不良反應報道，但缺乏有力依據。本實驗通過復方失笑散對小鼠的急性毒性實驗研究，為該處方的安全性進行科學、客觀評估，為本課題的進一步研究提供依據。

1 材料

1.1 試藥與儀器

復方失笑散主要由川楝子、延胡索、白芍、枳殼、當歸、五靈脂等11味藥材組成，均購于成都中醫藥大學附屬醫院中藥房；采用水提法將藥材浸泡，熱回流提取3次，去渣合并，藥液濃縮至1.6 g(生藥)/mL，裝瓶，4℃冰箱保存備用。HZT-A+200 型電子天平(福州華志科學儀器有限公司)；LMQ-R-3260B高壓蒸汽滅菌器(山東新華)。

1.2 實驗動物

昆明種小鼠，雌雄各半，SPF級別，體重18～22g，由四川省中醫藥研究所實驗動物中心提供，動物合格許可證號：SCXK(川)2013-19。

1.3 飼養條件

室內溫度為23～27℃，相對濕度為45%～55%，明暗周期為12/12h，分籠飼養，試驗期間自由飲用滅菌純化水(滅菌方法：經121℃滅菌30min，有效期為14天)，食用標準：普通柱狀飼料。

2 方法[1-5]與結果

2.1 半數致死量(LD50)預實驗

2.1.1 藥物劑量與配制 復方失笑散流浸膏，深棕色，最大劑量濃度為1.6g(生藥)/mL，臨用前用滅菌純化水配制藥液，預實驗設三個劑量組，組間劑量比為1∶ 0.7，給藥劑量分別為生藥64.00g(生藥)/kg、44.80g(生藥)/kg、31.36g(生藥)/kg，等容積不等濃度灌胃小鼠，給藥容積為0.4mL/10g。

2.1.2 分組與給藥 KM小鼠24只，預先適應性飼養4天，按體重隨機分為三組，每組8只，雌雄各半，給藥前禁食不禁水14h。按照實驗劑量設計單次灌胃小鼠，給藥后嚴密觀察并記錄小鼠的一般情況(行為、皮毛、攝食量、分泌物、排泄物、體重變化等)及中毒、死亡情況，2h后自由飲水和進食，對瀕死及死亡動物及時進行尸檢，肉眼觀察主要臟器心、肝、脾、肺、腎有無病理變化，若發現異樣，及時進行病理組織學檢查，連續觀察14天。

2.1.3 結果 給藥后，小鼠喜靜臥，活動量減少，大便稍濕，于第2 天恢復正常，實驗期間小鼠均無明顯中毒現象，無死亡，皮毛光澤，眼、鼻、口、耳無異常分泌物，飲食與排泄物均正常，未見其他異常行為發生，結果見表1。預實驗結果表明，本品的半數致死量(LD50)無法測出。

表1 復方失笑散LD50測定結果

2.2 最大給藥量試驗

2.2.1 分組與給藥 KM小鼠40只，標記，稱重，按體重隨機分為給藥組和空白對照組，每組雌、雄各半，給藥前禁食不禁水14h，給藥組以本品可供灌胃小鼠的最大濃度1.6g/mL，最大給藥容積0.4mL/10g，24h內灌胃給藥3次(相當于臨床成人用量的217.4倍)，間隔時間為4h。空白對照組給予等容積的滅菌水，給藥2h后自由飲水和進食，觀察期14天。

2.2.2 觀察指標 給藥前及給藥后每天固定時間，測量小鼠體重、飼料和水加入量與剩余量。觀察給藥后所有小鼠一般狀態，包括行為活動、皮毛色澤、鼻眼和口耳有無異常分泌物及瞳孔擴大或縮小，腹部脹氣或收縮，大便性狀與顏色，并記錄各組小鼠毒性反應及死亡情況等。觀察期結束后，脫頸椎處死小鼠，剖檢各組小鼠主要臟器是否病變，并測定肝、心、脾、肺、腎、雌鼠卵巢、子宮及雄鼠睪丸的濕重，計算臟器系數。

2.2.4 結果 對小鼠一般情況的影響：每次給藥后及每天進行一次觀察統計。①運動指標：一次給藥后，部分動物2min后出現整理毛發、自主活動減少，喜靜臥不動；第2次給藥后，部分小鼠1min后出現探究、整理毛發，自主活動減少；第3次給藥后情況同第2次，第2天小鼠基本恢復正常。②胃腸指標：一次給藥約2h后，個別小鼠大便稍稀，第2次給藥約1.5h后，個別小鼠出現大便稀，肛周有污黑現象，第3次給藥后同第2次，第2天，癥狀緩解，大便成形但稍濕，第3 天基本恢復正常。③其他指標：三次給藥后及觀察期內，小鼠均未出現抽搐、肌顫、麻痹，對外界反應靈敏，瞳孔無擴大或縮小，眼瞼無下垂，分泌物未見異常，呼吸正常。試驗期間，小鼠無明顯毒性反應，無死亡。對小鼠體重的影響： 給藥前禁食14h，各組小鼠體重均有下降，給藥后恢復正常進食飲水，各組動物體重呈增長趨勢。雌性小鼠，給藥組與對照組均數比較，體重均無顯著性差異(P>0.05)；雄性小鼠，兩組均數比較，除第3 天有顯著性差異(P<0.05)，其它均無明顯差異，結果見表2、圖1。對小鼠進食量的影響： 灌胃后恢復進食，各組小鼠進食量均有所降低，且給藥組小鼠進食量顯著降低，于第3天后均恢復正常，并呈增長趨勢。雌性小鼠，與對照組比較，除了給藥當天進食量有顯著差異(P<0.05)，其它均未見明顯差異；雄性小鼠的進食量，與對照組比較，均未見顯著性差異，結果見表3、圖2。對小鼠飲水量的影響： 灌胃后各組小鼠恢復正常飲水，給藥組的動物飲水量顯著增加，對照組增加不明顯，之后均呈正常增長趨勢，給藥組與對照組飲水量均數比較，均未見明顯差異，結果見表4、圖3。對小鼠主要臟器的影響： 剖檢小鼠，肉眼觀察結果顯示，各組動物主要臟器心、肝、脾、肺、腎、子宮、卵巢/睪丸均未見病變等異常。與對照組比較，給藥組臟器系數均無顯著性差異(P>0.05)，結果見表5。

表2 復方失笑散急性毒性實驗對小鼠體重的影響 ±s，g)

圖1 復方失笑散急性毒性實驗對小鼠體重的影響

圖2 復方失笑散急性毒性實驗對小鼠進食量的影響

表3 復方失笑散急性毒性實驗對小鼠進食量的影響±s，g)

表4 復方失笑散急性毒性實驗對小鼠飲水量的影響 ±s,mL)

圖3 復方失笑散急性毒性實驗對小鼠飲水量的影響

表5 復方失笑散急性毒性實驗對小鼠主要臟器系數的影響±s,n =10)

注：臟器系數 = 臟器重量(g) /動物體重(g) ×100。

3 討論

本方在半數致死劑量(LD50)實驗中未發現動物死亡，說明復方失笑散的毒性較低，以本品最大給藥濃度和最大給藥體積在24h內灌胃小鼠3次，給藥后，部分動物表現為多聚少動，且個別小鼠出現大便稀，肛周有污黑現象，分析原因可能與大劑量灌胃給藥有關，肛周污黑是由稀便引起，并于第2～3天逐漸恢復正常。

連續觀察14天發現，雄性小鼠，給藥組體質量與對照組比較，第3天有統計學差異(P<0.05)，分析是由藥效引起稀便造成，未發現有關毒理信息，從均數上可見給藥組動物體重總體呈逐日增長趨勢。給藥當天，各組小鼠進食量均有所減少，且雌性小鼠進食量與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)，可能是在滿負荷灌胃刺激下，小鼠產生一定的脹腹感和不適感而引起，之后呈正常增長趨勢,均未見統計學差異。小鼠飲水量的變化，與空白組比較無顯著性差異，肉眼觀察動物各主要臟器，未發現明顯異常，且各臟器系數均在同一水平。

復方失笑散的臨床常用生藥劑量為0.88g·kg-1·d-1(按照成人體重的 60kg換算)，本品小鼠急性毒性實驗的最大給藥濃度64g(生藥)·kg-1、最大給藥體積 40mL·kg-1在24 h內灌胃小鼠3次，則小鼠1 天累計最大給藥量為 192g(生藥)·kg-1，相當于成人臨床推薦劑量的 217.4倍。結合對動物一般狀態、體質量、進食量、飲水量及主要臟器系數的影響結果，均表明復方失笑散的毒性較低，臨床常用劑量安全性高。

[1] 陳奇.中藥藥理研究方法學[M] .第3版.北京:人民衛生出版社,2011:107-132.

[2] 《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》課題研究組.中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則[S].2005:1-8.

[3] 陳淑云,卞如濂,陳修,等.藥理實驗方法學[M].第3版.北京:人民衛生出版社,2002:227-231.

[4] 周繼剛,賀海波,周創,等.益貞顆粒急性毒性實驗研究[J].三峽大學學報：自然科學版,2013,35(5):110-113.

[5] 蔣平,楊陽,孫陽,等.養胃顆粒灌胃給藥對小鼠的急性毒性實驗[J].時珍國醫國藥,2014,25(4):841-843.

(責任編輯：宋勇剛)

Experimental Study on Acute Toxicity of Formula Jinlingsinisiwushixiao Powder on Mice

Bai Chunxia1，Sun Guojuan2，Xie Ping2*，Feng Jian2*，Jiang Chuan1，Li Qian1，Cui Jingyi1

(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610032, China; 2.The Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610032, China)

Objective:The acute toxicity study of Formula Jinlingsinisiwushixiao Powder on mice was investigated to guide the clinical applications.Methods:The median lethal doses(LD50) was determined by the pre-experiment of acute toxicity with single taking gavage different dosage to the mice.To measure the maximum dosage,the mice were given the highest concentration and largest volume drug 3 times a day,and were observed for successive 14 days.Results:The maximum dosage was 192g(crude drug) /kg,which is equivalent to 217.4 times of the clinical dose,and did not cause any acute toxicity.Conclusion:Formula Jinlingsinisiwushixiao Powder is of low toxicity,which are relatively safe and reliable to be taken at the prescribed dosage.

Formula Jinlingsinisiwushixiao Powder; KM mice; LD50; The Maximum Dosage

2014-10-20

國家自然科學基金資助項目(81373680)

白春霞(1988-)，女，成都中醫藥大學碩士研究生，研究方向為中藥化學成分及中藥質量標準。

謝萍(1965-)，女，成都中醫藥大學教授，主任醫師，碩士生導師，研究方向為中醫婦科腫瘤，E-mail:fxp2410@126.com；馮儉(1963-)，男，成都中醫藥大學教授，碩士生導師，研究方向為中藥化學成分及中藥制劑，E-mail:fengjan222@tom.com

R285.5

A

1673-2197(2015)05-0005-03

10.11954/ytctyy.201505003