澤瀉湯對Ox-LDL介導的血管平滑肌細胞SM22a表達的影響

鄧陽陽，魏 偉，陳 彤， 薛偕華

(1.福建中醫藥大學，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州 350003)

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澤瀉湯對Ox-LDL介導的血管平滑肌細胞SM22a表達的影響

鄧陽陽1，魏 偉2，陳 彤1， 薛偕華2

(1.福建中醫藥大學，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州 350003)

目的：觀察澤瀉湯對VSMCs標志性蛋白SM22a表達的影響，研究其在抑制VSMCs表型轉化方面的作用。方法：用Ox- LDL(0.05mg/mL)處理大鼠VSMCs 24h，經澤瀉湯醇提取物低中高濃度(0.075mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL)干預24h，免疫細胞化學法檢測表型轉化標志性蛋白SM22a的表達情況。結果：與空白組比較，模型組(Ox-LDL誘導)SM22a表達明顯降低(P<0.05)；經澤瀉湯干預后，SM22a蛋白表達水平較模型組顯著增加(P<0.05)，且隨濃度增高呈遞增趨勢(P<0.05)。結論：澤瀉湯能明顯上調表型轉化標志蛋白SM22a的表達，表明澤瀉湯有一定的抑制VSMCs表型轉化的作用。

澤瀉湯；動脈粥樣硬化；血管平滑肌細胞；表型轉化

動脈粥樣硬化(Athmsclerosis，AS)的發病率逐年升高，已經成為嚴重影響人類健康的疾病之一，且近年來有年輕化的趨勢。血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMCs)的活化、遷移與增殖是AS病變發展的必要條件[1]。而眾多研究表明，VSMCs由收縮型轉化為合成型是VSMCs獲得病理性遷移和增殖的先決條件[2]，同時合成型VSMCs合成與分泌各種細胞因子和細胞外基質，在AS斑塊形成和發生發展過程中發揮重要作用。因此對VSMCs表型轉化進行研究，對AS的防治具有重要意義。 澤瀉湯由澤瀉、白術配伍組成，為歷代醫家治療痰飲眩暈的效方。現代臨床及實驗研究表明，本方具有利水、改善循環、降脂、抗AS等藥理作用，應用范圍較為廣泛，但對其抗AS發病機理中VSMCs表型轉化的影響研究較少。因此本實驗采用Ox-LDL誘導體外培養VSMCs，經不同濃度澤瀉湯干預后，觀察其對VSMCs表型轉化能力的影響，研究其對抑制VSMCs 表型轉化的作用，為澤瀉湯的抗AS作用提供實驗和臨床研究依據。

1 材料與儀器

1.1 動物及藥物

清潔級SD雄性大鼠40只，購自福建醫科大學實驗動物中心[許可證號:SCXK(閩)2012-0001]。澤瀉湯方：澤瀉60g,白術30g，購自福建中醫藥大學附屬康復醫院藥劑科。澤瀉、白術劑量嚴格按《金匱要略》 原方劑量比例制劑并提供，以上藥物均經鑒定，符合《中華人民共和國藥典》(一部)2005年版有關規定。

1.2 儀器與試劑

DMEM/F12培養基購自Hyclone有限公司；胎牛血清購自FAA有限公司；氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL,1.67mg/L)購自北京協生生物科技公司；SM22a抗體購自Abcam公司；DAB免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司；細胞培養箱(Therom公司，美國)；Leica DM IL LED倒置顯微鏡。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 大鼠VSMC分離培養 頸椎脫臼處死大鼠，無菌條件下，取頸總動脈，放于含1%雙抗的20%胎牛血清的DMEM/F12培養基的培養皿中，剝離外層成纖維細胞、內層內皮細胞，剪碎VSMCs后，將其置于1.5mLEP管中，加入500μL II性膠原酶，放入37℃培養箱中過夜后，將EP管中組織液轉移至25cm2培養瓶中，加入3mL 1%雙抗的20%胎牛血清的DMEM/F12的培養基，置于37℃培養箱中培養。 待細胞融合至80%時，0.25%胰酶消化傳代， 取6～8代細胞進行試驗。

2.1.2 澤瀉湯制備 按照中藥醇提法提取澤瀉湯，澤瀉湯復方90g(澤瀉60g，白術30g)，按上述組方稱取藥材，加8倍量75%乙醇浸泡0.5h，加熱回流2次，每次1.5h，過濾，濾液合并，旋轉蒸發儀減壓濃縮，真空干燥成浸膏約15g，-20℃凍存備用。精密稱取澤瀉湯醇提取浸膏20.6mg，加2.06mL超純水溶解，超聲30min，0.22μm濾膜過濾，配制成10mg/mL母夜。以無雙抗20%胎牛血清的培養基分別稀釋成0.075mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL作為干預培養基。

2.1.3 細胞干預分組 實驗分為三組：空白組：大鼠VSMCs+無雙抗20%培養基，培養24 h。模型組：大鼠VSMCs +含Ox-LDL (0.05mg/mL)的無雙抗20%培養基，培養24h。澤瀉湯干預組(低、中、高劑量組)：大鼠VSMCs +含Ox-LDL (0.05mg/mL)和澤瀉湯低中高濃度(0.075mg/m、0.3mg/mL、0.6mg/mL)無雙抗20%培養基，培養24h。

2.1.4 免疫細胞化學法檢測SM22a表達 分組和處理方法同“2.1.3”項， 嚴格按照試劑盒說明書操作方法進行。采用SM22a陽性染色以胞質出現棕黃色或棕褐色為準。選染色均勻的區域，在100倍視野下,取陽性平均灰度值做統計分析。

2.2 結果

與空白組比較，模型組SM22a表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，澤瀉湯組SM22a表達顯著增加，且隨澤瀉湯濃度增高呈升高趨勢(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 免疫細胞化學法檢測SM22a表達 (×200)

組別SM22a陽性平均灰度值空白組98.180±1.734*模型組(Ox-LDL0.05mg/mL)58.276±0.824澤瀉湯低劑量組(0.075mg/mL)69.199±0.351*澤瀉湯中劑量組(0.3mg/mL)74.260±1.083*△澤瀉湯高劑量組(0.6mg/mL)83.846±1.310*△◇

注：與模型組比較，*P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05；與中劑量組比較，◇P<0.05。

3 討論

動脈粥樣硬化(atherosclerosls，AS)是西方發達國家的主要死亡原因[3]，隨著我國人民生活水平提高和飲食習慣的改變，該病也逐漸成為主要死因。AS的發生機制十分復雜，目前認為多種細胞參與AS病變的形成，包括巨噬細胞、淋巴細胞、內皮細胞和VSMCs[4]。VSMCs是一種高度特化的細胞，具有收縮型和合成型2種表型[5]，細胞表型決定了細胞的生物學特性和功能。正常VSMCs為收縮型，細胞呈紡錘形，含有豐富的肌絲和結構蛋白，主要維持動脈管壁的正常功能，無增殖以及遷移能力；合成型VSMCs分化程度低或未分化，呈扁平形，肌絲和結構蛋白含量少，與合成有關的細胞器豐富，分化、增殖以及合成和分泌基質蛋白能力強，并可遷移入內膜，形成相關病理改變。在多種病理因素的作用下，VSMCs的表型可由收縮型轉化為合成型[6]，此過程稱為表型轉化。SM22a是近年發現的一種VSMCs表型標志基因，僅在收縮型VSMCs中高表達，具有高度特異性[7-8]。焦磊等[9]以氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)作用于VSMCs，結果顯示SM22a表達下調，表明Ox-LDL促進了VSMCs由收縮型向合成型轉化。本實驗以Ox-LDL(0.05mg/mL)體外誘導VSMCs，免疫細胞化學檢測SM22a的表達，結果亦顯示，與空白組相比，模型組SM22a表達明顯降低。

近年來中藥在抑制VSMCs的表型轉化方面研究越來越受到關注，李琦等[10]研究發現黃芪和當歸不僅能抑制bFGF誘導的VSMCs增殖， 而且還可有效逆轉bFGF誘導的VSMCs表型轉化。車賢達等[11]研究發現麝香保心丸能促使血管平滑肌細胞的表型從合成型向收縮型轉化。 澤瀉湯出自東漢張仲景《金匱要略》，現代臨床及實驗研究表明,澤瀉湯具有利水、改善循環、降脂、抗AS等藥理作用，應用范圍較為廣泛。王玉仙等[12]應用澤瀉湯加味治療高脂血癥，發現該方可改善臨床癥狀，而且能調節患者血脂水平。但是澤瀉湯對VSMCs表型轉化影響方面還未見研究，本實驗在Ox-LDL處理VSMCs的基礎上予以澤瀉湯干預后，結果顯示，與較模型組對比，其SM22a表達顯著上調，并且呈一定的濃度依賴性。

綜上所述，本研究表明，Ox-LDL促進了VSMCs由收縮型向合成型轉化，而澤瀉湯具有抑制VSMCs表型轉化的作用，從而發揮其抗AS作用。對于澤瀉湯通過何種途徑來抑制VSMCs的表型轉化，還需要進一步研究。

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(責任編輯：宋勇剛)

2014-12-20

國家自然科學基金項目(81473744);福建省衛生廳中醫藥科研項目(WZSY201304);福建省衛生系統中青年骨干人才培養項目 (2013-ZQN-20-28)

鄧陽陽(1986-)，女 ,福建中醫藥大學碩士研究生，研究方向為腦血管疾病的基礎與臨床研究。

薛偕華(1978-)，男，福建中醫藥大學附屬康復醫院主任醫師，副教授，研究方向為腦血管疾病的基礎與臨床研究。

R285.5;R972+.6

A

1673-2197(2015)05-0008-02

10.11954/ytctyy.201505004