家蠅幼蟲雙翅肽MdDpt I成熟肽基因的克隆與原核表達

孫小寧裴志花卞 路張丹丹馬紅霞

（1.吉林農業大學動物科學科技學院，長春130118；2.遼寧省農業經濟學校，遼寧錦州121001；3.吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春130118）

家蠅幼蟲雙翅肽MdDpt I成熟肽基因的克隆與原核表達

孫小寧1，裴志花1，卞 路2，張丹丹1，馬紅霞1，3?

（1.吉林農業大學動物科學科技學院，長春130118；2.遼寧省農業經濟學校，遼寧錦州121001；3.吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春130118）

對雞沙門氏菌誘導家蠅幼蟲構建的抑制性消減文庫（SSH）中篩選得到的家蠅雙翅肽 I（Musca domesticaDiptericin I，MdDptI）基因進行克隆、表達，并對表達產物的抑菌活性進行初步研究。以沙門氏菌誘導家蠅幼蟲cDNA為模板，采用cDNA末端快速擴增技術（RACE，對MdDptI基因進行擴增，并對擴增產物進行測序和生物信息學分析，進一步去掉信號肽并構建重組表達質粒pET－28a－MdDptI，轉化大腸桿菌BL21（DE3，IPTG誘導表達，對表達產物進行SDS－PAGE電泳分析。借助親和純化獲得目的蛋白，并驗證目的蛋白的生物活性。MdDptI基因全長為419 bp，包含一個300 bp的完整開放閱讀框（ORF，編碼99個氨基酸，其cDNA序列與GenBank中登錄號為FJ794602.1的家蠅雙翅肽基因同源性為95%。構建了家蠅MdDptI基因的成熟肽原核表達質粒pET－28a－MdDpt－I，并獲得成功表達，表達產物約為12 ku，與預期結果一致。純化后的目的蛋白表現出一定的抑菌活性。本試驗獲得了MdDptI基因的全長序列，構建了原核表達載體，并成功獲得表達純化。

家蠅；家蠅雙翅肽；克隆；序列分析；原核表達

雞源沙門氏菌（salmonella）是引起雞白痢和雞傷寒的主要病原菌，該病原菌具有2500多種血清型，不同血清型沙門氏菌可引發不同的人獸共患病，威脅人畜健康和公共衛生安全［1］。目前，國內外主要采用抗生素對沙門氏菌引起的疾病進行預防和治療，而抗生素的不合理應用造成了該病原菌耐藥性的產生，使得藥物的治療劑量不斷加大，不但增加了用藥成本，也造成了藥物殘留，給養禽業帶來嚴重經濟損失［1－2］。因此，尋找新型、綠色、安全的抗菌劑代替抗生素，已成為當前國內外抗菌藥物研究的一項重要內容。

抗菌肽（antibacterial peptides）是生物體內產生的一類具有抗菌活性的小分子多肽，已經開始受到研究人員的重視。家蠅從幼蟲到成蟲均表現出很強的環境適應能力，其體內外常攜帶多種病原菌，卻極少出現集體發病的現象，就是源于其體內產生的多種抗菌肽及抗菌蛋白［3］。昆蟲雙翅肽作為抗菌肽中的重要組成成員對耐藥菌株有明顯的殺傷作用，且對正常體細胞沒有破壞作用，主要對革蘭氏陰性菌具有抑制作用［4］。為此，本研究以雞源沙門氏菌誘導三日齡家蠅幼蟲后構建的家蠅幼蟲抑制性消減文庫中篩選出來的雙翅肽差異基因為基礎，對MdDptI進行克隆及原核表達，以期為進一步研究其表達產物抗雞致病性沙門氏菌的活性及其他免疫學活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 文庫、菌株和表達載體 雞源沙門氏菌誘導家蠅3日齡幼蟲SSH文庫，3’和5’－RACE Ready cDNA由吉林農業大學獸醫藥理學實驗室完成［5］。大腸桿菌感受態菌株DH5α、BL21（DE3）、原核表達載體pET－28a（＋）均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及工具酶 SMARTTMRACE cDNA Amplification購自KitClontech公司。Ex TaqTMDNA聚合酶、限制性內切酶EcoR I、XhoI、Hind III、pMD18－T載體試劑盒、DL 2000TMDNA Marker、λ－Hind III digest DNA Marker、T4 DNA Ligase，均購自寶生物工程（大連）有限公司。異丙硫代β－D半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（AMP），均購自北京鼎國有限公司。DNA凝膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司。其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物合成和DNA測序 引物合成和重組質粒測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.2.2 雙翅肽基因的3’－RACE擴增和5’－RACE擴增 以雞源沙門氏菌誘導的家蠅3日齡幼蟲SSH文庫中篩選的雙翅肽序列，分別設計 3’－RACE和5’－RACE特異性擴增引物。5’－RACE特異性擴增引物 Gsp1（5’－CCGACGATAAGTCA?CAGCCACCTCC－3’），3’－RACE特異性擴增引物Gsp2（5’－CCACCACCACGGTAATCAGGACGAC－3’），并按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說明書進行RACE擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離、回收目的DNA片段，與PMD－18T載體進行連接，轉化DH－5α感受態細胞，將酶切驗證篩選后的陽性克隆送樣測序。

1.2.3 生物信息學分析 通過DNAMAN軟件將克隆到的5’和3’末端序列拼接得到家蠅的全長cDNA序列。在 NCBI網站 http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi對全長cDNA序列進行BLASTN分析。運用在線工具http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html尋找該序列的開放閱讀框（ORF）并翻譯成蛋白質序列。使用SignalP 4.1 Server在線工具預測該蛋白質序列前體信號肽，計算該蛋白的分子質量和等電點。利用NCBI網站http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi對MdDptI基因編碼蛋白的保守區域進行搜索。

1.2.4MdDptI基因成熟肽的擴增 利用Primer5.0軟件自行設計引物。所設計的引物序列為：（GSP3：5’GGGGGAATTCGACGATAAGTCACAG3’；GSP4：5’GCGCTCGAGCTACCATCTGTAAGTG3’），并在5’端分別添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點。以家蠅3日齡幼蟲5’－RACE Ready cDNA模板進行擴增。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離、回收目的DNA片段，與PMD－18T載體進行連接，轉化DH－5α感受態細胞，將EcoRⅠ＋XhoⅠ酶切驗證篩選后的陽性克隆送樣測序。該重組質粒命名為pMD18－T－MdDptI。

1.2.5 構建原核表達質粒pET－28a－MdDptI 將pMD18－T－MdDptI克隆重組質粒及表達載體pET－28a（＋）用限制性內切酶EcoR I＋XhoI進行雙酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳后，分別回收MdDptI片段和pET－28a表達載體片段，經過連接并轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞。提取質粒進行雙酶切鑒定，將獲得的陽性質粒送樣測序。該重組質粒命名為pET－28a（＋）－MdDptI。

1.2.6 重組質粒的表達及SDS－PAGE分析 將pET－28a－MdDptI陽性質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取陽性單克隆菌落接種于含Kan的300 mL液體培養基中，待OD600值在0.6～0.8之間，加入IPTG進行誘導表達。取300 mL菌液離心收集菌體，將誘導菌液進行超聲波破碎后分別取上清和沉淀進行SDS－PAGE電泳［6］。

1.2.7 融合蛋白的親和純化 收集菌體后用TE（pH 8.0）洗滌沉淀2次，洗滌后對菌體超聲破碎，4℃ 12000 r／min離心30 min，收集破碎后上清液，進行純化，操作過程參照 GE healthcare的 His TrapTMHP說明書進行。

1.2.8 融合蛋白抑菌活性檢測 收集融合蛋白，借助牛津杯法，檢測融合蛋白對沙門氏菌的抑菌活性。取100 μL菌液（105cfu／mL）均勻涂布于LB平板上，放入牛津杯，杯內加入100 μL蛋白，37℃培養12 h，觀察抑菌活性大小。

2 結果

2.1MdDptI基因的RACE擴增 3’RACE和5’RACE擴增產物經測序分析，結果顯示，3’RACE獲得一條450 bp的片段，5’RACE獲得一條490 bp的片段（圖1），拼接后得到419 bp的全長序列。

圖1 MdDptI基因的3’和5’RACE擴增

2.2 序列分析MdDptI基因全長 419 bp。BLASTN分析發現MdDptI基因 cDNA序列與GenBank中登錄號為FJ794602.1家蠅雙翅肽基因同源性為95%。用NCBI的ORF Finder分析MdDptI基因的開放閱讀框，該基因全長300 bp，編碼99個氨基酸。利用SignalP4.1程序預測N端包括20個氨基酸殘基的信號肽，說明其為分泌型蛋白。MdDptI成熟肽由79個氨基酸殘基組成。理論分子量為 8.79 kD，理論等電點為 8.27，富含 Gly（15.19%）、Asp（11.39%）、Pro（10.13%）、Arg（8.86%）。運用NCBI的CDD程序對MdDptI基因編碼成熟肽的保守區域進行搜索，結果顯示擴增的MdDptI基因編碼的成熟肽與Attacin＿C超家族（Attacin＿C superfamily）保守區域一致（圖2）。

圖2 NCBI中MdDptI成熟肽保守結構域分析

2.3MdDptI成熟肽片段的克隆 根據MdDptI基因的成熟肽基因序列，擴增得到一條240 bp的片段（圖3A）。重組質粒pMD18－T－MdDptI的雙酶切（圖3B）和測序驗證顯示，MdDptI基因被成功克隆。

圖3 MdDptI成熟肽基因的PCR擴增和pET－28a－MdDptI的雙酶切鑒定

2.4 構建原核表達質粒pET－28a－MdDptI pET－28a－MdDptI重組質粒雙酶切后，獲得240 bp和5369 bp的片段（圖4），分別為MdDptI和pET－28a（＋）。表明MdDptI基因原核表達重組質粒構建成功。

圖4 重組質粒的酶切鑒定

2.5 重組質粒在大腸桿菌中表達產物的 SDSPAGE分析MdDptI的理論分子量約為8.8 ku，pET－28a（＋）載體具有his標簽蛋白，分子量約為3 ku。經過SDS－PAGE電泳檢測，與未誘導樣品比較，菌株在預期位置12 ku大小附近出現目的蛋白條帶（圖5）。

圖5 重組質粒pET－28a－MdDptI在大腸桿菌中表達產物的SDS－PAGE分析

2.6 融合蛋白的純化 取純化后的融合蛋白進行Tricine－SDS－PAGE電泳檢測，可見分子量約為12 ku的融合蛋白條帶（圖6）。

圖6 純化融合蛋白MdDptI

2.7 融合蛋白抑菌活性檢測 實驗以洗脫液為對照和純化后融合蛋白進行抑菌效果檢測，由圖7可見，融合蛋白對沙門氏菌的抑菌圈直徑為9 mm，而空白對照沒有抑菌圈，說明融合蛋白對沙門氏菌有抑菌作用。

圖7 融合蛋白對沙門氏菌的抑菌試驗

3 討論

抗菌肽的合成成本高，而大部分抗菌肽對蛋白酶都敏感，且抗菌肽或是對宿主菌本身又有毒性，或是表達的產物本身不具有抑菌活性，實驗發現采用融合表達可以降低其堿性，并暫時改變抗菌肽的構像而降低其對宿主菌的毒性，增加產物的穩定性，避免被蛋白酶酶降解，所帶的分子標簽通過親和層析來純化［7］。因此，本文利用親和層析技術純化來獲得活性較高的家蠅雙翅肽MdDptI。抗菌肽作為昆蟲先天免疫系統中非常重要的一類效應分子，當昆蟲被病原微生物感染后，可通過受體模式識別入侵病原微生物，激活Toll或Imd信號途徑，通過NF－κB（Nuclear transcription factor κB）核轉錄因子調控抗菌肽基因的表達，合成高效廣譜的抗菌肽，殺滅外源微生物［8］。這些抗菌肽是從昆蟲免疫器官分泌，主要從脂肪體釋放進入血淋巴中，其濃度可以達到1～100 mM［9］，能阻止病原微生物的繼續侵染。家蠅抗菌肽作為新型抗菌藥物，研究主要集中在家蠅防御素（defensin）、家蠅攻擊素（attacin）、家蠅天蠶素（cecropin）等方面，家蠅雙翅肽作為attacin中的主要成員，其分子的C端富含Gly，N端富含Pro，分子量為8～27 ku，主要抑制革蘭氏陰性菌，但目前關于雙翅肽的作用機制還不明確［10］，有待進一步研究。

目前關于雙翅肽的研究大多集中于對雙翅肽的克隆以及表達模式。楊小蓉通過克隆得到家蠅抗菌肽基因diptericin并對其編碼區蛋白進行原核表達［11］，但未切除信號肽序列。王麗娜對MdDpt基因的成熟肽進行了克隆與表達并進行MdDpt抗血清的制備［12］，二者都未就其抑菌活性進行研究。目前，關于MdDptI成熟肽的抑菌活性研究的報道很少，本研究將MdDptI基因的信號肽編碼序列切除，只保留成熟肽基因，將其序列插入到載體pET－28a（＋）中，構建重組表達質粒，并在BL21菌體中獲得高效表達。本實驗由于前期切除了信號肽序列，使其表達產物結構理論上更接近于MdDptI從脂肪體中釋放到血淋巴中的天然構象，成為一種陽離子多肽，彌補了MdDptI基因體外表達后難以正確折疊的不足，并且確定了MdDptI對沙門氏菌的抑菌活性。本研究為MdDptI的表達、純化以及抑菌機制的研究提供了參考。

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（編 輯：侯向輝）

Cloning and Prokaryotic Express of Diptericin I GeneMdDptI Mature Peptide Chain inMusca domesticaLarvae

SUN Xiao－ning1，PEI Zhi－hua1，BIAN Lu2，ZHANG Dan－dan1，MA Hong－xia1，3?
（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；2.Economy of Liaoning Province Agriculture School，Liaoning，Jinzhou121001，China；3.Animal Production＆Product Quality and Security of the Ministry of Education，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China）

The study was done to clone and express gene ofMdDptI（Musca domesticaDiptericin I）being screened from SSH library bysalmonella，in order to lay the foundation for its bioactivity evaluation.Using cDNA end rapid amlification technology（RACE），MdDptI gene’s full－length cDNA was amplified，then recombonant expression plasmid was reconstructed using pET－28a，transformed intoE.coliBL21（DE3）and then induced by IPTG，the recombinant protein was verified by SDS－PAGE.With the aid of affinity to obtain purified fusion protein，the fusion protein was verified.The full－length cDNA ofMdDptI gene was 419 bp，in size，the openreading frame was 300 bp，encoding a 99－aminoacid protein，the homology of this gene’s cDNA sequence with theMdDptI from GenBank was up to 95%.The mature peptide recombonant expression plasmid pET－28a－MdDptI ofMdDptI gene was constructed，and the protein ofMdDptI gene was expressed successfully with the size of 12 ku，The purified fusion protein showed certain antibacterial activity.The result showed that the recombinant plasmid pET－28a－MdDptI was constructed correctly，which paved the way for further studies on theMdDptI protein expression and its biological activities.

Musca domestica；Musca domestica diptericin；clone；sequence analysis；prokaryotic expression

2014－09－14

A

1002－1280（2015）01－0001－05

S852.743

教育部新世紀優秀人才項目（NCET－10－0174）；吉林省世行貸款農產品質量安全項目（2011－Y05）；吉林省科技廳項目（20111820）

孫小寧，碩士，從事抗菌肽研究。

馬紅霞。E－mail：hongxia0731001＠163.com