豬瘟兔化弱毒E2基因重組桿狀病毒的構建及抗體制備

范學政，徐 璐，趙啟祖，寧宜寶，鄒興啟，朱元源，丁家波，王 琴

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

豬瘟兔化弱毒E2基因重組桿狀病毒的構建及抗體制備

范學政，徐 璐，趙啟祖，寧宜寶，鄒興啟，朱元源，丁家波，王 琴?

（中國獸醫藥品監察所，北京100081）

為制備豬瘟特異性抗體，將豬瘟兔化弱毒E2基因序列修飾后克隆到pFastBac1質粒載體，經轉座、轉染后構建重組桿狀病毒，并用純化的重組豬瘟E2蛋白免疫大耳白兔制備特異性抗體。實驗結果表明成功獲得能分泌重組豬瘟E2蛋白的桿狀病毒，使用純化的重組豬瘟E2蛋白制備的豬瘟抗體具有良好的特異性和敏感性，為豬瘟病毒熒光抗體染色液的制備奠定了基礎。

豬瘟病毒；E2基因；桿狀病毒表達；抗體制備

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的一種高度接觸性傳染病，給養豬業造成了巨大的經濟損失。CSFV E2糖蛋白，既是研究新型疫苗的主要對象，也是建立CSFV血清學檢測方法的首選抗原［1－2］。目前E2基因已在多個表達系統中進行表達，并且利用表達產物作為CSFV ELISA診斷抗原和亞單位疫苗進行了探索［3－6］。豬瘟病毒免疫熒光檢測是豬瘟疫苗種毒鑒定、豬瘟病毒分離和臨床診斷的重要技術，但現有豬瘟高免血清非特異性強，

染色背景深，而豬瘟單抗因只能針對一個表位，盡管特異性好，但敏感性稍差。為獲得特異性好，敏感性高的豬瘟抗體，本研究嘗試將豬瘟兔化弱毒（hog cholera lapinised virus，HCLV）E2基因用桿狀病毒進行表達，并用純化的重組豬瘟E2蛋白免疫大耳白兔，采血、純化后制備豬瘟特異性抗體，為豬瘟病毒熒光抗體染色液的制備進行前期探索。

1 材料與方法

1.1 材料 豬瘟兔化弱毒、ST細胞系、酶標E2單抗WH303（WH303?HRPO）：本實驗室保存；pFastBac1質粒、DH10Bac菌、sf9細胞、SNAP MidiPrep Kit為Invitrogen公司產品；HisTrapTMHP Nie＋純化柱為GE Healthcare產品；日本大耳白兔，1～2 kg，購自北京維通利華實驗動物有限公司；FITC標記羊抗兔抗體、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑為Sigma公司產品；Protein A抗體純化柱為ACRO Biosystem公司產品；BCA蛋白定量試劑盒為pierce公司產品；其他為常規試劑。

1.2 方法

1.2.1 重組轉移載體構建及桿粒制備 采用PCR克隆和酶切連接方法在豬瘟兔化弱毒E2基因N端加上蜂素信號肽（MELs），C端加上6HIS序列，一并克隆到pFastBac1質粒，經測序鑒定后，命名為pFastBacE2。將 其 轉 化 DH10Bac，用 SNAP MidiPrep Kit提取重組桿粒，并命名為bE2。

1.2.2 轉染及病毒鑒定 將重組桿粒bE2轉染sf9細胞，操作過程按說明書進行。獲得的病毒經PCR方法鑒定后，命名為rBacVE2。

1.2.3 表達產物分析鑒定 將rBacVE2重組病毒用sf9細胞傳代培養，取培養上清用ELISA方法進行分析。操作過程為：取病毒培養液8000 r／min離心5 min，取上清，用 PEG8000包埋濃縮，再用NaHCO3包被液稀釋10倍，每孔包被100 μL，4℃過夜；棄包被液，加PBSM（PBS，加5%脫脂奶粉）37℃封閉40 min；吸干，用 PBST（PBS，加0.5% Tween20）洗3次，將WH303?HRPO用PBSTM稀釋1000倍，每孔加入100 μL，37℃溫育40 min；吸干，用PBST洗3次，每孔加入TMB工作液100 μL，避光作用 10 min，加入 50 μL終止液（2 mol／L H2SO4），測吸光值（450 nm）。

1.2.4 重組豬瘟E2蛋白純化 用rBacVE2重組病毒接種sf9細胞擴大培養，接種后72 h收集培養液，8000 r／min離心5 min，將上清裝入透析袋，用聚乙二醇 8000包埋濃縮。濃縮液用 HisTrapTMHP Nie＋純化柱純化，純化蛋白用SDS－PAGE電泳分析，用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.5 免疫及陽性血清制備 將純化的重組豬瘟E2蛋白免疫日本大耳白兔，首次免疫用完全弗氏完全佐劑乳化，皮下多點免疫200 ug／只。30 d后二次免疫，弗氏不完全佐劑乳化，皮下多點免疫200 ug／只。再過30 d后用純化的重組豬瘟E2蛋白腹腔注射免疫200 ug／只。7 d后采血分離血清。將血清用Protein A抗體純化柱純化，獲得豬瘟E2抗體。用SDS－PAGE電泳分析，測定蛋白濃度后置－40℃保存。

1.2.6 間接免疫熒光驗證 將處于對數生長期的ST細胞系傳代，加至24孔板，待細胞長至60%～80%滿時，吸干培養基，接種稀釋好的豬瘟兔化弱毒（1000 TCID50／0.1mL），每孔0.5 mL，37℃ 5% CO2培養箱中吸附1.5 h后換2%NBS的MEM維持液每孔0.5 mL，37℃ 5%CO2培養箱中培養48 h后，吸干培養液，加入預冷的丙酮 ∶甲醇（1∶1）0.5 mL，固定30 min，吸干，風干后每孔加入0.5 mL PBS漂洗一次。將制備的豬瘟E2抗體用的5%馬血清的PBS按 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600稀釋，各稀釋度每孔加200 uL，37℃溫育1 h，棄抗體液，PBS漂洗三次，然后加入FITC標記羊抗兔抗體（1∶300稀釋），每孔200 uL，37℃溫育1 h后，用PBS漂洗三次。置倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 重組轉移載體及重組桿粒的構建 將Mels、HCLV E2和6His標簽克隆入pFastBac1，經篩選鑒定獲得了重組轉移載體pFastBacE2，轉化DH10Bac后進行篩選，獲得的重組桿粒 PCR擴增條帶為3400 bp，證明獲得了正確桿粒bE2。

2.2 轉染、病毒鑒定及表達分析 將重組桿粒bE2轉染sf9細胞，提取重組病毒DNA經PCR鑒定后，擴增出了3400 bp目的條帶，證明轉染成功，獲得了重組病毒rBacVE2。對培養上清用WH303?HRPO檢測，結果出現特異的ELISA反應（表1），表明E2蛋白獲得了分泌性表達。

表1 用WH303?HRPO對細胞培養上清表達產物進行ELISA檢測結果

2.3 重組豬瘟E2蛋白純化 結果見圖1。對重組豬瘟 E2蛋白經濃縮、Nie＋純化柱純化和 SDSPAGE電泳表明，純化產物分子量為55 kD左右，與理論值相符，Western blot鑒定結果表明純化蛋白與酶標單抗WH303?HRPO有良好反應，結果證明獲得了純的重組豬瘟E2蛋白。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度為2.5 mg／mL。

2.4 豬瘟E2抗體的制備 免疫后采血分離血清，將血清用Protein A抗體純化柱純化，結果獲得了純度較高的豬瘟E2抗體（圖2）。BCA蛋白定量試劑盒測定抗體濃度為2.1 mg／mL。

2.5 間接免疫熒光驗證 將制備的豬瘟E2抗體用24孔板做免疫熒光驗證，結果表明，隨著稀釋度的增加，免疫熒光逐漸減弱，而1∶50有輕微非特異性背景，1∶100和1∶200倍稀釋效果最佳（圖3）。

圖1 重組E2蛋白純化后SDS－PAGE和Western blot圖

圖2 純化的豬瘟E2抗體SDS－PAGE圖

圖3 純化抗體免疫熒光鑒定

3 討論

昆蟲桿狀病毒表達系統（Baculovirus expression system，BEVS）是一種高效的真核表達系統，能有效進行蛋白質的翻譯后加工，表達產物的生物學活性與天然蛋白十分接近，特別適合于真核蛋白的制備研究，已成功表達了多種功能蛋白。豬瘟病毒E2糖蛋白是該病毒最主要的特異性抗原蛋白，用原核系統表達的E2蛋白盡管能與豬瘟抗體反應，但不管是包涵體表達［3］還是可溶性表達［4］，難以制備亞單位疫苗，用其組裝的試劑盒反應性也欠佳。這說明其翻譯后加工及空間構象對蛋白功能和抗原性十分重要，只有真核表達系統才能獲得有活性的蛋白［5－6］。

豬瘟病毒E2蛋白的羧基端由約40個氨基酸殘基組成的跨膜區，疏水性極強，對表達有一定的影響［6］。因此，本試驗去掉了C段的跨膜區，同時在末端加上一段柔性短肽和六聚組氨酸純化標簽，利用Nie＋可特異結合六聚組氨酸的特性，獲得了高純度的重組E2蛋白。另外，用重組E2蛋白免疫大耳白兔，將分離的血清用Protein A純化，工藝簡單，且獲得的抗體純度高，特異性強，可滿足診斷試劑的指標要求。

豬瘟病毒免疫熒光檢測是豬瘟疫苗種毒鑒定、豬瘟病毒分離和臨床診斷的重要技術，尤其在豬場豬瘟凈化中應用較為廣泛［7－8］，但實際應用中發現，豬瘟高免血清制備的熒光抗體非特異性較強，染色背景往往較深，給結果判定帶來困難。而豬瘟單抗因只能針對一個表位，敏感性稍差。本研究用桿狀病毒表達的重組豬瘟E2蛋白免疫大耳白兔，制備的豬瘟E2抗體特異性好，可用于豬瘟病毒免疫熒光染色液的制備，為豬瘟疫苗種毒鑒定、豬瘟臨床病原檢測等提供了一種方便實用的工具。

［1］Min Lin，Trottier E，and Mallory M.Enzyme－linked immunosorbent assay based on a chimeric antigen bearing antigenic regions of structural proteins erns and E2 for serodiagnosis of classical swine fever virus infection［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2005，12（7）：877－881.

［2］van Rijn P A.A common neutralizing epitope on envelope glycoprotein E2 of different pestiviruses：implications for improvement of vaccines and diagnostics for classical swine fever（CSF）？［J］.Vet Microbiol，2007，125（1／2）：150－156.

［3］范學政，王 琴，陳振海，等.豬瘟兔化弱毒株E2基因的原核表達及間接ELISA的初步建立［J］.中國病毒學，2005，20（3）：253－256.

［4］徐璐，范學政，王 琴，等.豬瘟病毒石門株E2基因4個抗原結構域的原核表達［J］.中國農業科學，2006，39（4）：814－818.

［5］Hulst M M，Westra D F，Wensvoort G，et al.Glycoprotein E1 of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera［J］.J Virol，1993，67（9）：5435－5442.

［6］范學政，徐 璐，王 琴，等.豬瘟病毒E2基因密碼子優化后在昆蟲細胞中的表達［J］.中國獸醫雜志，2011，47（5）：3－5.

［7］陳義鋒，趙亞榮，趙建增，等.豬瘟熒光熒光抗體的制備及應用［J］.中國獸藥雜志，2008，12：16－19.

［8］權中會，王小平，惠臨風，等.豬瘟熒光抗體的制備及應用［J］.中國獸醫科技，2004，03：39－41.

（編 輯：李文平）

Construction of Recombinant Baculovirus Expressing HCLV E2 Gene and Antibody Preparation

FAN Xue－zheng，XU Lu，ZHAO Qi－zu，NING Yi－bao，ZOU Xing－qi，ZHU Yuan－yuan，DING Jia－bo，WANG Qin?
（China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing100081，China）

In order to prepare antibody for detection of classical swine fever virus（CSFV），the E2 gene of vaccine strain hog cholera lapinised virus（HCLV）was cloned into vector pFastBac1， through thransposon and transfection，a recombinant baculovirus carried HCLV E2 gene was constructed and recombinant E2 protein was expressed.After immuning rabbits with recombinant E2 protein expressed by baculovirus，the antibodies against CSFV was prepared.The results showed that the recombinant baculovirus could secret E2 protein，and the antibodies had good specificity and could be used to prepare detection reagent for CSFV.

CSFV；E2 gene；BEVS；antibody preparation

2014－10－09

A

1002－1280（2015）01－0006－04

S852.65＋1

農業部“948”項目（2006－G57）

范學政，副研究員，從事預防獸醫學研究。

王 琴。E－mail：wangqin＠ivdc.org.cn