日本乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒的研制及初步應用

李 建，廖園園，秦紅剛，劉 潔，朱 薇，漆世華，韓 興，徐 松，舒銀輝，謝紅玲

（武漢中博生物股份有限公司，武漢430070）

日本乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒的研制及初步應用

李 建，廖園園，秦紅剛，劉 潔，朱 薇，漆世華，韓 興，徐 松，舒銀輝，謝紅玲?

（武漢中博生物股份有限公司，武漢430070）

采用日本乙型腦炎病毒單克隆抗體預包被酶標板，將純化的日本乙型腦炎病毒（JEV）作為檢測用抗原，利用包被捕獲法建立了用于檢測豬乙型腦炎抗體的間接ELISA法。采用建立的ELISA法對50份已知陰性血清樣本檢測，臨界OD450nm值為0.343，ELISA與IFA對200份血清進行平行檢測，總符合率為92.9%，與商品化的同類國產試劑盒的符合率為95%。與其他常見的豬病毒陽性血清抗體無交叉反應，2～8℃保存12個月穩定。研制的ELISA抗體檢測試劑盒為臨床JEV血清抗體檢測及其疫苗的免疫效果評價提供了技術手段。

日本乙型腦炎病毒；間接ELISA；試劑盒；抗體

豬乙型腦炎病是由乙型腦炎病毒引起的嚴重威脅人畜健康的一種中樞神經系統傳染病［1］。在動物中，豬是本病的主要傳染源，該病在大多數養豬場呈地方流行，是引起母豬繁殖障礙的疾病之一。該病對豬致死率不高，但能引起懷孕母豬流產、死胎或木乃伊胎，也能引起公豬睪丸急性炎癥反應或不育［2］。目前已經建立多種檢測JEV的方法［3］，包括病毒分離、分子生物學診斷技術、酶聯免疫吸附試驗等，這些方法在病原檢測或抗體檢測中各有特點，在該病的診斷中發揮了重要的作用。如何在此基礎上開發純度高、性能穩定的檢測試劑以及更容易在生產實踐中推廣應用的快速檢測方法，仍然是今后乙腦病毒疾病防治的一個重點。為建立一種敏感、特異、快速的乙型腦炎病毒抗體檢測方法，使JEV疫苗的效果評價更快捷、準確和方便，本研究利用捕獲包被和間接ELISA法研制了一種檢測JEV抗體的試劑盒，并初步應用于豬場JEV疫苗免疫之后的效果評價。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 倉鼠腎細胞（BHK－21）購自invitrogen，SP2／0細胞系購自中檢所；JEV為本公司保存；FITC標記羊抗小鼠IgG（Thermo公司）、HRP標記羊抗小鼠（Thermo公司）、DMEM培養基（Hyclone公司）、HAT（Sigma公司）、HT（Sigma公司）、單抗亞類鑒定試劑盒（洛陽賽爾維公司）；豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒（武漢科前動物生物制品有限公司）；超速離心機（Beckman）；酶標儀；洗板機。

1.2 抗原的制備 將乙型腦炎病毒（JEV）按照0.01MOI接種到BHK－21細胞中，37℃培養72～96 h，收獲細胞培養物，經蔗糖密度梯度離心［4］純化后進行電鏡檢測。

1.3 動物免疫 將一定量的JEV與等體積的弗氏完全佐劑混合并完全乳化后，小鼠腹股溝兩側靠近淋巴結區和頸部皮下多點免疫，每次免疫間隔21 d。

1.4 細胞融合 按照常規方法［5］無菌采取小鼠脾細胞，與骨髓瘤細胞按10∶1比例混合，用PEG進行融合，將融合之后的細胞加入鋪好飼養細胞的96孔板中。

1.5 單抗的篩選 利用間接ELISA、IFA和IPMA法對所培養的雜交瘤上清進行檢測，有限稀釋法對檢測陽性的雜交瘤細胞進行至少三次以上的克隆直至陽性率為100%為止。

1.6 單克隆抗體的亞類測定 按照洛陽賽爾維公司單抗亞類試劑盒說明書進行單克隆抗體亞類的測定。

1.7 腹水的生產及其純化 選擇12周齡以上的雌性BALB／c小鼠，腹腔注射單克隆雜交瘤細胞，7 d之后收取小鼠腹水，采用鹽析法純化腹水。

1.8 雜交瘤細胞的染色體分析 按常規方法［6］對雜交瘤細胞的染色體進行分析，于高倍顯微鏡下觀察，每份樣本應計數100個中期完整的核細胞，記錄染色體數目的分布。

1.9 ELSIA試劑盒的制備 按照方陣滴定方法［7］優化ELISA反應條件，確定日本乙腦病毒單克隆抗體和抗原的包被濃度。對一抗和二抗的最佳稀釋濃度和反應時間進行優化。

1.9.1 判定標準的確定 選用間接免疫熒光（IFA）檢測JEV抗體陰性豬血清50份，經ELISA檢測結果進行統計學分析，統計其平均值和標準差，計算陰陽性值的臨界點。

1.9.2 特異性檢測 取同一批次的ELISA試劑盒對200份豬血清進行檢測，觀察結果，并與IFA結果進行比較。

1.9.3 靈敏度檢測 空白對照液：0.01 mol／L，pH＝7.4的PBS。梯度濃度的樣品液：用0.01 mol／L，pH＝7.4的稀釋的抗體，濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125 μg／mL梯度濃度。

1.9.4 穩定性檢測 空白對照液：0.01 mol／L，pH＝7.4的PBS。樣品液：用0.01 mol／L的PBS稀釋的濃度分別為0.5、1 μg／mL抗體。同一批次的ELISA試劑盒分別放4℃和37℃，1周和2周后對上述對照液和樣品液進行檢測，觀察結果。

1.10 ELISA抗體試劑盒與商品化同類試劑盒的比較試驗 用自制ELISA抗體檢測試劑盒與從武漢科前動物生物制品有限公司購買的豬乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒進行比較。

1.11 ELISA抗體檢測試劑盒在臨床上的應用 從武漢地區某豬場采集327份豬血清，進行ELISA抗體水平檢測。其中屠宰豬血清182份，45日齡豬血清80份，35日齡豬血清 40份，20日齡豬血清25份。

2 結果

2.1 乙型腦炎病毒的純化 經蔗糖密度梯度離心共獲得5 mg乙型腦炎病毒抗原，電鏡結果可見病毒顆粒（圖1）。

圖1 JEV電鏡圖片（箭頭所指為JEV病毒粒子）

2.2 單克隆抗體的篩選

2.2.1 間接免疫熒光試驗（IFA） 單抗 1∶1000稀釋，FITC標記的抗小鼠IgG 1∶100稀釋，2株單克隆抗體均能與接種了JEV的BHK細胞發生反應，出現了綠色熒光，陰性對照未見熒光（圖2）。

2.2.2 免疫過氧化物酶單層實驗（IPMA） 單抗1∶1000稀釋，HRP標記羊抗小鼠IgG 1∶100稀釋，AEC顯色，2株單克隆抗體均能與感染了JEV的BHK細胞發生反應，出現紅色著染，陰性對照細胞未見陽性反應（圖3）。

圖2 JEV單抗的間接免疫熒光檢測結果

圖3 JEV單抗IPMA檢測結果

2.3 單克隆抗體亞類的測定 7F1亞類是IgG2a，10H3亞類是IgG2b。

2.4 腹水效價的鑒定 雜交瘤細胞上清的效價在1∶256，OD值在1.0左右，腹水的ELISA抗體效價均在1∶106以上。

2.5 雜交瘤細胞的染色體分析 雜交瘤細胞的染色體在95～110范圍內變化，平均值在98左右，該數值大于脾細胞染色體數的2倍，小于脾細胞與骨髓瘤細胞染色體數目之和，表明該雜交瘤細胞確實為脾細胞與骨髓瘤細胞融合的產物。

2.6 ELISA試劑盒檢測試驗

2.6.1 判定標準的確定 ELISA檢測血清的平均值為0.157，標準差為0.062，按樣品臨界值＝陽性樣品平均值＋3×標準差計算，其臨界值為0.343，將樣品OD450nm值≥0.343者判為陽性，介于 0.343～0.281為可疑，小于0.281為陰性。

2.6.2 ELISA試劑盒特異性試驗 ELISA檢測結果顯示：200份豬血清標本有127份陽性，73份陰性，同時用IFA檢測豬血清標本，118份陽性，82份陰性，二者總符合率為92.9%（表1）。

表1 ELISA與IFA抗體檢測結果比較表

2.6.3 ELISA試劑盒靈敏度試驗 靈敏度結果顯示，陰性對照和 0.125 μg／mL無陽性反應，0.25 μg／mL開始有陽性反應，并且隨著濃度的升高顏色逐漸加深。

2.6.4 ELISA試劑盒穩定性試驗 0.5、1 μg／mL純化抗體穩定性檢測結果見表2。

表2 ELISA穩定性檢測結果表

2.7 ELISA抗體試劑盒與商品化同類試劑盒的比較試驗 通過使用自制的ELISA抗體檢測試劑盒與購買的商品化的試劑盒相比較，陰陽性對照完全成立的情況下，自制ELISA抗體試劑盒在檢測樣品的敏感性方面要高于商品化的試劑盒（表3）。

表3 自制試劑盒與商品化試劑盒比較試驗結果表

2.8 試劑盒在臨床上的檢測 用已經建立的ELISA法對327份待檢豬血清進行JEV抗體的檢測結果（表4）表明，陽性頭數為59，陽性率為18%。

表4 不同日齡豬乙型腦炎ELISA抗體檢測結果

3 討論

在單克隆抗體制備的實驗中，抗原的純度至關重要，它直接決定著后期能否順利篩選到所需要的雜交瘤細胞株，因此，用蔗糖密度梯度離心的方法來純化日本乙型腦炎病毒，此方法除了對病毒損傷小，還能夠獲得較高純度的抗原。在單抗檢測環節，除了用常規的間接ELISA方法之外，還用IFA和IPMA來檢測篩選到的雜交瘤細胞株，這樣得到的單抗更加具有說服力。

自制乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒，用單克隆抗體包被捕獲JEV抗原，具有提高捕獲抗原的純度和檢測的特異性及敏感性的優點。目前市場上有不少廠家銷售乙型腦炎病毒ELISA抗體檢測試劑盒，商品化的試劑盒主要采用原核系統表達日本腦炎病毒中的某一個蛋白作為包被抗原，結合血清中的抗體檢測的方法。原核表達的蛋白沒有經過修飾，與天然病毒的構象相差較大，與抗體結合能力不如天然病毒能力強，因此，自制試劑盒的敏感性和特異性比較高。自制試劑盒與間接免疫熒光檢測JEV抗體及商品化的ELISA抗體檢測試劑盒的符合率分別為92.9%和93.8%，適合豬場血清抗體檢測，對于JEV流行病學的調查具有重要的意義［8］。下一步，應用本研究制備的單克隆抗體所生產的乙腦病毒抗體檢測試劑盒，申報產品，作為PCR等豬乙型腦炎病毒臨床快速診斷方法的補充和驗證。

［1］湯德元，郭萬柱.日本腦炎病毒及其疫苗的研究［J］.中國獸醫學報，2005，25（2）：217－221.

［2］Nga P T，del Carmen Parquet，M Cuong V D，et al.Shift in Japanese encephalitis virus（JEV）genotype circulating in northern Vietnam：implications for frequent introductions of JEV from Southeast Asia to East Asia［J］.J Gen Virol，2004，85（Pt6）：1625－1631.

［3］YUN S I，Kim S Y，Choi W Y，et al.Molecular characterization of the full－length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39［J］.Virus Res，2003，96（1／2）：129－140.

［4］杜念興.獸醫免疫學［M］.第2版.北京：中國農業出版社，1997.

［5］劉秀梵.單克隆抗體在農業上的應用［M］.合肥：安徽科學技術出版社，1994：32－36.

［6］章谷生，容秉培.單克隆抗體在醫學上的應用［M］.上海：上海科學技術出版社，1987.

［7］曹雪濤.精編免疫學實驗指南［M］.北京：科學出版社，2009.

［8］祖立闖，沈志強.乙型腦炎病毒間接酶聯免疫吸附試驗抗體檢測試劑盒的研制及其應用［J］.養豬，2011，（5）：98－102.

（編 輯：侯向輝）

Development and Primary Application of ELISA Kit for the Detection of Antibody against Japanese Encephalitis Virus

LI Jian，LIAO Yuan－yuan，QING Hong－gang，LIU Jie，ZHU Wei，QI Shi－hua，HAN Xing，XU Song，SHU Yin－hui，XIE Hong－ling?
（Wuhan Chopper Biological Co Ltd，Wuhan430070，China）

With capture coating method，indirect ELISA method for detecting Japanese encephlitis antibody was established using Japanese encephlitis virus monoclonal antibody to pre－coat ELISA plate and using purified Japanese encephlitis as detecting antigen.The ELISA was optimized and the kit was developed for checking the immune results of JEV vaccines.In comparison with inderect immunofluorescence（IFA），there was 92.9% coincidence between the ELISA and IFA based on detection of 200 serum samples.With the commercialization of the same kind of domestic kits，there was 95%coincidence.There was no cross reactions for the positive serums of other common Japanese encephlitis antibodies.The kit was stable kept up to 12 months at 2～8℃.The kit was used for clinical laboratory and detection of serum antibody.

Japanese encephalitis virus；indirect ELISA；kits；antibody

2014－09－15

A

1002－1280（2015）01－0010－04

S852.65

李 建，從事動物病毒體外診斷試劑的研究工作。

謝紅玲。E－mail：13419546263＠163.com