茯苓活性成分提取工藝優(yōu)化

蘭新財(cái)，吳葉鋒，王麥利，葉志惠，趙麗麗，姜正前

（1.浙江金大康動(dòng)物保健品有限公司，浙江金華321016；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，浙江金華321017）

茯苓活性成分提取工藝優(yōu)化

蘭新財(cái)1，吳葉鋒1，王麥利1，葉志惠1，趙麗麗1，姜正前2

（1.浙江金大康動(dòng)物保健品有限公司，浙江金華321016；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，浙江金華321017）

為了優(yōu)化茯苓有效成分的提取工藝，分別以茯苓酸和茯苓多糖含量為考核指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)確定因素和水平的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法分別對(duì)茯苓酸和茯苓多糖提取工藝進(jìn)行考察。優(yōu)選茯苓酸的最佳提取工藝為采用6倍藥材質(zhì)量的85%乙醇在55℃條件下提取1 h，優(yōu)選茯苓多糖的最佳提取工藝為采用10倍藥材質(zhì)量的水提取3次，每次2 h。優(yōu)選的提取工藝合理、穩(wěn)定、可行，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

茯苓酸；茯苓多糖；提取工藝；正交試驗(yàn)

茯苓為多孔科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf菌核的干燥菌核，其味甘、淡、平。具有利水滲濕、健脾、寧心的功能，主治水腫尿少，脾虛食少，便溏泄瀉，心神不寧等癥［1］?，F(xiàn)代研究表明，茯苓的主要有效成分為茯苓酸和茯苓多糖［2］。本研究在單因素試驗(yàn)確定因素和水平的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法篩選出茯苓藥材中茯苓酸和茯苓多糖的最佳提取工藝條件，為新藥研究和充分利用茯苓藥材資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 日本島津10Avp高效液相色譜儀，浙大智能N2000工作站。UV－1800PC紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）。

1.2 藥品 對(duì)照品（供含量測(cè)定用）：茯苓酸（含量99.05%）批號(hào)為YJ0616SA14，上海源葉生物科技有限公司；無水葡萄糖（含量以100.0%計(jì)）批號(hào)為110833－200904，中國藥品生物制品檢定所。中藥材購自浙江省金華泰來醫(yī)藥公司，并經(jīng)公司技術(shù)研發(fā)部鑒定。

1.3 試劑 水為純化水；乙腈為色譜純（天津星馬克科技發(fā)展有限公司）；其它試劑均為化學(xué)純。

1.4 方法

1.4.1 茯苓酸含量檢測(cè)方法

1.4.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 根據(jù)參考文獻(xiàn)方法［3－5］，Hypersil ODS－C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.5%磷酸溶液（70∶30）；流量：1.0 mL／min；檢測(cè)波長：207 nm；柱溫：30℃。

1.4.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定茯苓酸對(duì)照品適量，加甲醇制成0.10 mg／mL的對(duì)照品溶液。

1.4.1.3 供試品溶液的制備 精密量取茯苓醇提液10 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇適量，密塞，超聲30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾；取續(xù)濾液，即得。

1.4.1.4 樣品檢測(cè) 精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算含量。

1.4.2 茯苓多糖含量檢測(cè)方法 根據(jù)參考文獻(xiàn)方法［6－8］，對(duì)茯苓多糖含量進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2.1 總糖檢測(cè)方法 精密量取茯苓水提液3 mL（如有沉淀，需先加熱使溶解，放冷），置100 mL量瓶中，照《獸藥國家標(biāo)準(zhǔn)（化學(xué)藥品、中藥卷）第一冊(cè)》黃芪多糖注射液【含量】項(xiàng)下方法檢測(cè)。

1.4.2.2 單糖檢測(cè)方法 精密量取供試品1 mL（如有沉淀，需先加熱使溶解，放冷），加水60 mL，振搖使溶解，加氫氧化鈉試液至中性后，精密加入碘滴定液（0.05 mol／L）20 mL，照《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1－XG－026－2002第16冊(cè)》香菇菌多糖含量項(xiàng)下【單糖】方法檢測(cè)。

多糖含量%＝總糖含量%－單糖含量%

1.5 茯苓酸提取單因素試驗(yàn)

1.5.1 提取液量 取茯苓飲片6份，每份20 g，分別用2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、12倍75%乙醇，室溫浸泡30 min，提取30 min，提取液用濾紙過濾，45℃減壓濃縮至25 mL，照1.4.1項(xiàng)下方法考察茯苓酸含量差異（下同），以獲得最佳提取液量［9］。

1.5.2 乙醇濃度 取茯苓飲片6份，每份20 g，分別用45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇200 mL，室溫浸泡30 min，提取30 min，提取液用濾紙過濾，45℃減壓濃縮至25 mL，考察茯苓酸含量差異，以獲得提取溶媒最佳乙醇濃度。

1.5.3 提取溫度 取茯苓飲片6份，每份20 g，分別加75%乙醇200 mL，在25、35、45、55、65、75℃條件下浸泡30 min，在對(duì)應(yīng)條件下提取30 min，提取液用濾紙過濾，45℃減壓濃縮至25 mL，考察茯苓酸含量差異，以獲得最佳提取溫度。

1.5.4 提取時(shí)間 取茯苓飲片6份，每份20 g，分別加75%乙醇200 mL，室溫浸泡30 min，分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，提取液用濾紙過濾，45℃減壓濃縮至25 mL，考察茯苓酸含量差異，以獲得最佳提取時(shí)間。

1.6 茯苓多糖提取單因素試驗(yàn)

1.6.1 提取加水量 取茯苓藥材6份，每份40 g，提取時(shí)分別用4倍、6倍、8倍、10倍、12倍、14倍不同水量100℃提取30 min，取濾液濃縮至25 mL，照1.4.2項(xiàng)下方法考察茯苓多糖含量差異（下同），以獲得最佳加水量［9］。

1.6.2 提取時(shí)間 取茯苓藥材6份，每份40 g，提取時(shí)加12倍量水，分別100℃提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h各一次，濃縮至25 mL，考察茯苓多糖含量差異，以獲得最佳提取時(shí)間。

1.6.3 提取次數(shù) 取茯苓藥材4份，每份40 g，提取時(shí)每次加6倍量水，提取30 min，分別100℃提取1次、2次、3次、4次，合并提取液濃縮至25 mL，考察茯苓多糖含量差異，以獲得最佳提取次數(shù)。

1.7 正交試驗(yàn)

采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以茯苓酸含量為考察指標(biāo)，選擇提取液量（A）、乙醇濃度（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）四個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)三個(gè)水平，以確定最佳的茯苓酸提取工藝條件，其因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以茯苓酸多糖為考察指標(biāo)，選擇加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）三個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)三個(gè)水平，以確定最佳的茯苓多糖提取工藝條件，其因素水平表見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓酸提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取液量對(duì)茯苓酸提取的影響 不同提取液量對(duì)茯苓酸提取影響的結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取液量對(duì)茯苓酸提取的影響結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，8倍量的乙醇液提取所得提取物中茯苓酸含量最高。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)茯苓酸提取的影響 不同乙醇濃度對(duì)茯苓酸提取影響的結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)茯苓酸提取的影響結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著乙醇濃度的提高，茯苓酸含量呈增加趨勢(shì)。

2.1.3 提取溫度對(duì)茯苓酸提取的影響 不同提取溫度對(duì)茯苓酸提取影響的結(jié)果見圖3。

圖3 不同提取溫度對(duì)茯苓酸提取的影響結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，75℃以下的提取溫度對(duì)茯苓酸含量影響差異不顯著。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)茯苓酸提取的影響 不同提取時(shí)間對(duì)茯苓酸提取影響的結(jié)果見圖4。

圖4 不同提取時(shí)間對(duì)茯苓酸提取的影響結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間在1.5 h時(shí)茯苓酸含量最高。

2.2 茯苓多糖提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取水量對(duì)茯苓多糖提取的影響 不同倍數(shù)的提取水量對(duì)茯苓多糖提取影響的結(jié)果見圖5。

圖5 不同提取水量對(duì)茯苓多糖提取的影響結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，提取水量在10倍時(shí)，茯苓多糖含量最高。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)茯苓多糖提取的影響 不同提取時(shí)間對(duì)茯苓多糖提取影響的結(jié)果見圖6。

圖6 不同提取時(shí)間對(duì)茯苓多糖提取的影響結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，提取時(shí)間在2 h時(shí)，茯苓多糖含量最高。

2.2.3 提取次數(shù)對(duì)茯苓多糖提取的影響 不同提取次數(shù)對(duì)茯苓多糖提取影響的結(jié)果見圖7。

圖7 不同提取次數(shù)對(duì)茯苓多糖提取的影響結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，提取次數(shù)在3次時(shí)，茯苓多糖含量最高。

2.3 茯苓酸提取正交試驗(yàn) 結(jié)果見表3。

表3 茯苓酸提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 茯苓多糖提取正交試驗(yàn) 結(jié)果見表4。

表4 茯苓多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5 結(jié)果分析 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析，結(jié)果見表5、表6。

表5 茯苓酸提取方差分析

表6 茯苓多糖提取方差分析

以茯苓酸含量為考察指標(biāo)，表3中極差R值大小顯示，各因素作用主次為B3＞C3＞A2、D1；方差分析結(jié)果表明：各因素的影響無顯著性差異（P＞0.05），以A2B3C3D1組合最佳，即乙醇用量6倍、85%乙醇、提取溫度55℃、提取時(shí)間1 h。

以茯苓多糖含量為考察指標(biāo)，表4中極差R值大小顯示，各因素作用主次為B2＞A3＞C3；方差分析結(jié)果表明：B因素對(duì)茯苓多糖的提取有顯著性影響（P＜0.05），而A因素和C因素的影響無顯著性差異（P＞0.05），以A3B2C3組合最佳，即每次10倍水量，煎煮2 h，提取3次。

2.6 最佳提取工藝條件的驗(yàn)證 取同一批藥材，每份20 g，以茯苓酸和茯苓多糖含量為提取指標(biāo)，按擬定工藝條件分別進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)。茯苓酸提取工藝為：A2B3C3D1，RSD為2.92%，茯苓多糖提取工藝為：A3B2C3，RSD為2.36%。結(jié)果均無顯著差異。

3 討論

試驗(yàn)中茯苓酸含量測(cè)定方法中檢測(cè)波長的選擇［3－5］，取對(duì)照品和供試品，配成一定濃度的樣品，照紫外方法在紫外光區(qū)200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果在206、207、208 nm波長處有最大吸收。參照紫外允許有2 nm的漂移，確定茯苓酸的檢查波長為207 nm。同時(shí)，在207 nm處，專屬性和分離度均符合檢測(cè)要求。

單因素試驗(yàn)中，茯苓酸的提取含量隨著加液量及提取時(shí)間的增加而增加，但在提取液量8倍以上、提取時(shí)間1.5 h以上，含量反而下降，可能與三萜類化合物中含烯鍵，存在結(jié)構(gòu)變異與熱穩(wěn)定性等因素有關(guān)。茯苓多糖的提取含量隨提取液量、時(shí)間、次數(shù)的增加而增加，但在提取液量10倍以上、提取時(shí)間2 h以上、提取次數(shù)3次以上，含量反而下降，可能與多糖在水溶液中長時(shí)間加熱水解有關(guān)。

茯苓藥材中茯苓酸用6倍藥材質(zhì)量的85%乙醇在55℃提取1 h，茯苓多糖用10倍藥材質(zhì)量的水提取3次，每次2 h。優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定、可行，較超聲波提取法［10－11］提取茯苓酸和茯苓多糖，以及用水提醇沉、稀堿浸提法［12］提取茯苓多糖，不需要特殊設(shè)備，操作方便，安全環(huán)保，更適合工業(yè)化大生產(chǎn)。

經(jīng)單因素預(yù)試驗(yàn)，茯苓酸提取次數(shù)對(duì)其含量影響不顯著，故未納入正交試驗(yàn)。在單因素考察提取液乙醇濃度時(shí)，95%乙醇提取率高于其他濃度的乙醇，但考慮到大生產(chǎn)的安全性和經(jīng)濟(jì)性，故未將95%乙醇濃度納入正交試驗(yàn)。

［1］第四屆中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典2010年版二部［S］.

［2］高學(xué)敏.中藥學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：747.

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（編 輯：陳 希）

Optimization of Extraction Procession for Tuckahoe Active Ingredients

LAN Xin－cai1，WU Ye－feng1，WANG Mai－li1，YE Zhi－h(huán)ui1，ZHAO Li－li1，JIANG Zheng－qian2
（1.Zhejiang Jindakang Animal Health Co.，Ltd，Jinhua，Zhejiang321016，China；2.Jinhua College of Profession and Technology，Jinhua，Zhejiang321017，China）

The extraction procession of pachymic acid and pachyman from tuckahoe was optimized by single factor experiment and orthogonal design with content of pachymic acid and pachyman as the detective marker.The optimum extraction condition for pachymic acid was extracting with 6 folds of 85%alcohol at 55℃for 1 h under reflux.The optimum extraction condition for pachyman was extracting with 10 folds of water for 3 times，2 h at every time.The optimized extraction condition is reasonable and scientific，and it could be used in future largescaled preparation.

pachymic acid；pachyman；single factor experiment；orthogonal design

2014－09－23

A

1002－1280（2015）01－0014－05

S853.7

金華市科技局重點(diǎn)科研項(xiàng)目：防治高死亡率哺乳仔豬腹瀉中藥制劑的研發(fā)（項(xiàng)目編號(hào)：2012－2－004）

蘭新財(cái)，從事中獸藥的研究與開發(fā)。E－mail：635937520＠qq.com