常壓室溫等離子體結合紫外誘變篩選紅霉素高產菌株

沈小靜，張 萍，石彥鵬

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101）

常壓室溫等離子體結合紫外誘變篩選紅霉素高產菌株

沈小靜，張 萍，石彥鵬?

（寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101）

利用常壓室溫等離子體射流誘變（ARTP）和紫外照射對紅霉素產生菌進行復合誘變，得到4株產量明顯提高的突變菌株，4株菌的平均發酵效價較出發菌株提高25.2%；其中一株（12＃菌株）經發酵搖瓶驗證，紅霉素發酵單位可達10029單位／mL，比出發菌株提高了28.6%，且遺傳穩定性良好。實驗證明ARTP－UV復合誘變是一種簡單高效的篩選方法。

紅霉素；常壓室溫等離子體；紫外；復合誘變；遺傳穩定性

紅霉素（erythromycin，Er）是由紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea，也稱糖多孢紅霉菌）合成的次生代謝產物，為一類大環內酯類抗生素。目前我國已成為世界大環內酯類抗生素原料藥第一生產大國，但與發達國家相比仍有很大差距，大多數產品只是因為低人力成本而成為歐美和東南亞紅霉素類原料藥的主要供應國。因此，提高發酵單位和改善組分成為國內外紅霉素發酵過程面臨的主要問題。常壓室溫等離子體誘變（Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP）是近幾年發展起來的一種等離子體源，能夠在大氣壓下產生溫度在25～40℃之間的具有高活性粒子（包括處于激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）濃度的等離子體射流。其作用于生物大分子和細胞的效果明顯、微生物基因組突變速度快、多樣性大，而且ARTP操作方便、安全性高，已成功實現了30種以上微生物的突變，成為高效的微生物基因組突變新方法［1］。整合多種誘變方法進行的復合誘變，因其突變率高成為研究熱點，常使用的誘變方法有亞硝基胍化學誘變、紫外線照射誘變和等離子誘變［2］。對于化學誘變，若操作不慎會對實驗人員和環境造成很大的危害。與常規的菌株改造手段相比，ARTP對遺傳物質的損傷機制多樣，因而獲得突變型多樣性的可能性增大，具有對環境無污染、保證操作者的人身安全等很多獨特的優點。本文采用紫外線、等離子復合誘變方法，對紅色糖多孢菌進行誘變篩選，獲得了理想的高產紅霉素菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea），CGMCC，經寧夏泰瑞制藥股份有限公司分離純化得到生產能力穩定的菌株：EM13－165，用沙土管保藏。

1.1.2 主要設備 旋轉搖瓶機，XDW25／96型，四川長征制藥機械廠；紫外可見分光光度計，UV－1800，日本島津；恒溫、凈化工作系統；ARTP常壓室溫等離子體生物育種機，ARTP－Ⅱ型，北京思清源生物科技有限公司。

1.1.3 試劑及原料 黃豆餅粉、淀粉、棉籽餅粉、CaCO3均購自本地；玉米漿購自華北制藥康欣股份有限公司；NH4SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、糊精、蛋白胨、葡萄糖，均為天津市凱通化學試劑有限公司產品；紅霉素對照品（中國獸醫藥品監察所，批號：130307，含量：883 U／mg）。

1.2 方法

1.2.1 培養基及培養條件 參考文獻［3］，種子培養基：含淀粉，糊精，蛋白胨，葡萄糖，黃豆餅粉，NaCl，NH4SO4，MgSO4·7H2O，KH2PO4，CaCO3，pH 7.0。250 mL搖瓶裝種子培養基30 mL，28℃，200 r／min培養48～52 h。

發酵培養基：含正丙醇，CaCO3，MgSO4·7H2O，NH4SO4，淀粉，糊精，黃豆餅粉，棉籽餅粉，玉米漿，葡萄糖，pH 7.0。250 mL搖瓶裝種子培養基30 mL，121℃滅菌30 min。接種量10%，28℃，220 r／min培養7 d。

1.2.2 ARTP誘變操作 以99.99%氦氣作為工作氣體，氦氣流量10 SLM；處理功率120 W；樣品與等離子體發生器出口距離2 mm；處理樣品為20 μL孢子懸液。為了尋找最佳的誘變處理時間，首先分別考察了照射時間為20、40、60、80、100、120 s時的細胞致死率。對處理過的樣品在適當的稀釋度下涂板，采用活菌計數法（CFU）計算致死率并獲得致死曲線。

1.2.3 紫外照射誘變與ARTP復合誘變 采用先紫外線誘變后等離子誘變的方法。取新鮮斜面加入生理鹽水制成孢子懸液，玻璃珠打碎，過濾，收集單孢子懸液，控制濃度為107個／mL左右。取2 mL孢子懸液加入 φ 90 mm玻璃培養皿中，在距離30 W紫外燈30 cm下照射30 s。將紫外誘變后的孢子懸液進行等離子體誘變。取20 μL紫外誘變后的菌懸液滴在專用圓形不銹鋼載片上，誘變處理40 s，將載片放入有1.5 mL生理鹽水的離心管進行復蘇，充分振蕩混勻。稀釋到一定倍數，取100 μL稀釋菌液涂布平板，32℃培養9～11 d。按照上述誘變操作程序，平行誘變8塊載片并涂平板。根據菌落生長的大小、圓整和豐度，隨機挑選單菌落進行搖瓶初篩和復篩。

1.2.4 紅霉素標準曲線制備方法 參考文獻［4］精密稱量紅霉素對照品0.0502 g，置100 mL容量瓶中，加乙醇20 mL溶解，用水稀釋至刻度。精密量取0～5 mL，分別置于100 mL的容量瓶中，定容后使其最終濃度相當于含紅霉素0、1、5、10、20、30、40、50 mg／L。分別加入硫酸溶液（5 mol／L）12 mL，在80℃水浴7 min，取出立即水浴冷卻至室溫，用硫酸溶液稀釋至刻度，在483 nm處測定吸光度，以效價為縱坐標，吸光度為橫坐標，做回歸方程（r≥0.999），列表備用。

1.2.5 發酵液化學效價檢測方法 本法［5］是硫酸水解法，即紅霉素經硫酸水解后呈黃色，于483 nm處有極大吸收值，可以定量測定。在發酵液經離心后，根據確定好的倍數吸取一定量的濾液，用0.35%碳酸鉀液稀釋。然后，取稀釋液20 mL于分液漏斗中，加入醋酸丁酯20 mL，振搖30 min，放置分層，棄去下層水液，于丁酯液中加入無水硫酸鈉1 g左右（可酌量多加使丁酯液澄清），振蕩至透明。準確吸取其上層脫水液10 mL于另一干燥的分液漏斗中，精確加入鹽酸（0.1 mol／L）10 mL，振蕩30 min，放置分層，把下層鹽酸水液放入試管中，從中吸取5 mL放入另一試管中，加入硫酸（8 mol／L）5 mL，搖勻，放入 50℃水浴中，保溫 30 min取出冷卻。在483 nm處測定吸光度值，同時以蒸餾水為空白，用所得的吸光度值查標準曲線。效價＝查出數×稀釋倍數。

1.2.6 菌株遺傳性狀穩定性實驗 將4株高產突變株在斜面培養基上連續傳代4代，然后按1.2.1項進行同批發酵培養，測定其化學效價并進行分析比較，檢測菌株遺傳性狀是否穩定。

1.2.7 12＃突變株生物學特性研究方法

1.2.7.1 生長曲線 將12＃突變株及出發菌株分別接入種瓶培養基中，按1.2.1項方法進行培養，分別于10、20、30、40、50 h取樣按體積法測定其菌濃。

1.2.7.2 不同pH條件下的生長情況 將12＃突變株及出發菌株分別接入不同pH（4、5、6、7、8、9、10）的種瓶培養基中培養，于 50 h按體積法測定其菌濃。

1.2.7.3 生長溫度范圍 將12＃突變株及出發菌株分別接入種瓶培養基中，分別置于20、25、28、35℃進行培養，于50 h按體積法測定其菌濃。

2 結果與分析

2.1 紅霉素標準曲線 結果如圖1所示。

圖1 紅霉素標準曲線圖

2.2 ARTP誘變致死率曲線 結果如圖2所示。

圖2 紅色糖多孢菌的ARTP誘變致死率曲線圖

由圖2可知，ARTP對紅色糖多孢菌具有很強的致死效應，按方法1.2.2項對菌體的致死率進行計算，ARTP處理60 s時，其致死率達到了99.2%。根據誘變理論研究，80%～90%的致死率有利于正突變菌株的產生［6－8］，而過高的誘變劑量導致存活菌落生長微弱，無篩選價值，因此本實驗選擇致死率為89%左右、照射時間40 s進行誘變篩選。

2.3 紫外照射誘變與ARTP復合誘變 出發菌株EM13－165經常壓室溫等離子體射流誘變與紫外照射復合誘變后，自分離培養皿中得到216個單菌落，挑取單菌落接斜面后，初步篩選出27株效價提高的正突變菌株。由于這27株菌中還可能存在遺傳不穩定或者試驗操作誤差篩選的高產菌株，為了獲得準確的遺傳穩定的高產突變菌株，還需從這些初篩菌株中重復篩選。復篩結果如圖3所示。復篩最終按照效價提高20%的標準篩選出2＃，10＃，12＃，17＃4株突變株。由結果可知，利用ARTP－UV篩選到的正突變株占初篩菌株的12.5%，其中突變株12＃搖瓶發酵化學效價最高，達到10029單位／mL，比出發菌株提高了28.6%。

圖3 27株菌株與原始菌株效價的比較圖

2.4 突變菌株遺傳穩定性的驗證 為了驗證突變株的遺傳穩定性，對篩選到的4株高產突變株2＃，10＃，12＃，17＃進行遺傳穩定性的比較。將4株高產突變株連續傳代4代，然后同批進行搖瓶驗證，結果如圖4所示。

突變株2＃，10＃，12＃和17＃較出發菌株分別提高了20.8%、25.2%、28.6%和26.1%。經過連續傳代4次，其效價分別下降了6.2%、3.3%、1.6%和8.9%。相比于其他3株菌，12＃突變株具有較高的產量，且具有良好的遺傳穩定性。

2.5 突變菌生物學特性研究 對獲得的12＃突變株進行生物學特性研究實驗，通過與出發菌株比較生長曲線、pH和溫度范圍，結果如圖5所示。

圖4 高產突變株2＃，10＃，12＃，17＃連續傳代4次的遺傳穩定性

圖5 出發菌株與12＃突變株生長曲線（a）、不同pH條件下的生長情況（b）及生長溫度范圍的比較（c）

由圖5中a可以看出，出發菌與突變菌的生長趨勢基本一致，都能快速進入對數生長期，只是突變菌比出發菌要生長稍快一些。圖5中b通過研究兩株菌的生長pH范圍，發現突變菌和出發菌在pH 5～10范圍均能生長，兩者的最適生長pH一致。由圖5中c可知，突變菌與出發菌的最適生長溫度是28℃。

3 討論與小結

由于大多數生產菌株已被傳統誘變方法反復誘變，因此對傳統誘變方法具備了一定抗性和飽和性。等離子誘變作為一種新興的誘變方法，能在一定程度上彌補傳統誘變方法在這方面上的缺陷。阿維鏈霉菌、發孢甲基變菌、酶母菌等微生物通過ARTP誘變，突變速度快、突變庫多樣性大，并成功地篩選獲得高產突變株［9－10］，但這種誘變方法在紅霉素選育相關文獻中未見有報道。本研究采用這種新型的常壓室溫等離子體協同紫外誘變作用于紅色糖多孢菌，獲得了一株紅霉素產量明顯提高的突變菌株12＃，其發酵單位可達10029單位／mL，比出發菌株提高了28.6%。通過生物學特性研究實驗，出發菌與突變菌的生長趨勢基本一致，兩者的最適生長pH一致，突變菌與出發菌的最適生長溫度都是28℃。通過傳代培養，紅霉素產量能穩定維持在高水平，表明經復合誘變獲得的這株突變菌的遺傳穩定性高。

實驗表明ARTP誘變育種技術是一種新型、有效的微生物誘變育種方法，可與傳統誘變方法結合為改善微生物的生產能力提供了一條新的途徑，其能夠用于誘變紅霉素產生菌，且誘變效果顯著。本文的實驗結果均是在搖瓶條件下得到的，由于搖瓶培養過程中營養、溶氧和pH等條件不進行調控，所以菌種的優良性能并沒有得到很好的發揮，在生產應用時還需要通過發酵罐對其代謝特性進行分析，并進一步優化其發酵條件及培養基組成，以達到最佳水平。

［1］陳韻億，金麗華，李和平，等.常壓室溫等離子體非轉基因生物誘變木糖代謝產油酵母的方法及特性研究［J］.食品科學，2012，33：213.

［2］宋道軍，姚建銘，邵春林，等.離子注入微生物產生“馬鞍型”存活曲線的可能作用機制明［J］.核技術，1999，22（3）：129－132.

［3］華承偉，于江傲，謝鳳珍.紅色鏈霉菌發酵產紅霉素培養基的響應面優化［J］.中國生物制品學雜志，2011，24（6）：728－729.

［4］南京藥學院.藥物分析化學［M］.南京：江蘇科技出版社，l985：265－272.

［5］范代娣，黨 政，孫曉紅，等.紅霉素搖瓶發酵實驗工藝條件［J］.西北大學學報，2000，30（1）：43－44.

［6］張曉勇，陳秀霞.低能離子誘變育種作用機理及生物學效應研究進展［J］.廣東農業科學，2008，（6）：20－22.

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（編 輯：侯向輝）

A Mutant Strain with High Erythromycin Yield Obtained by Using Novel Atmospheric and Room Temperature Plasmas and UV Mutation

SHEN Xiao－Jing，ZHANG Ping，SHI Yan－Peng?
（Ningxia Tairui Pharmaceutical Co Ltd，Yinchuan750101，China）

Atmospheric and room temperature plasma（ARTP）－UV composite mutagenesis were adopted to treat with erythromycin－producing strain，four high－efficient producing strains were obtained by screening，which was increased in fermentation potency by 25.2%over the original strain.The mutant 12＃with genetic stability was obtained.Its yield of erythromycin was 10029 U／mL，28.6%higher than the original strain.ARTP－UV composite mutation was a simple and efficient method for screening.

erythromycin；atmospheric and room temperature plasma（ARTP）；ultraviolet（uv）；composite mutagenesis；hereditary stability

2014－11－12

A

1002－1280（2015）01－0019－05

S859.796

沈小靜，碩士，從事抗生素發酵菌種培養、選育研究。

石彥鵬。E－mail：shiyanpeng＠tairuiworld.com