分枝桿菌噬菌體CJAUS5株holin基因的克隆與序列分析

蔣依倩齊 宇劉文賢姜秀云高云航徐鳳宇?

（1.吉林農業大學動物科技學院，長春130118；2.吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春130118；3.吉林農業大學生命科學院，長春130118）

分枝桿菌噬菌體CJAUS5株holin基因的克隆與序列分析

蔣依倩1，2，齊 宇1，劉文賢1，2，姜秀云1，3，高云航1，2，徐鳳宇1，2?

（1.吉林農業大學動物科技學院，長春130118；2.吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春130118；3.吉林農業大學生命科學院，長春130118）

為了研究噬菌體裂解宿主菌的機制，開發噬菌體裂解相關蛋白的應用價值，試驗參照GenBank中登錄的holin基因序列設計特異性引物，以分枝桿菌噬菌體CJAUS5基因組為模板，經PCR擴增出411 bp的條帶。構建重組質粒pMD19－T－holin，經雙酶切鑒定呈陽性后進行測序分析。結果顯示，克隆出的holin基因與已知分枝桿菌肌尾噬菌體holin序列同源性高達99.03%～99.51%；編碼的氨基酸同源性高達99%～100%。對holin基因編碼的蛋白進行分析表明，Holin蛋白具有親水性C端和兩個跨膜區域。研究成功克隆了分枝桿菌噬菌體CJAUS5的holin基因并進行了氨基酸序列分析，為進一步研究Holin蛋白的生物學特性及功能奠定了基礎。

分枝桿菌；噬菌體；holin；基因克隆；序列分析

Key words：mycobacterium；bacteriophage；holin；gene cloning；sequence analysis

分枝桿菌包括結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌三大菌群，目前發現的已有150多個種，其中一些種可引起多種動物及人類疾病，包括結核病、麻風病以及副結核病等，給畜牧業帶來巨大經濟損失的同時還嚴重威脅著人類健康。隨著全球性細菌耐藥問題的出現，耐藥結核分枝桿菌的數量不斷增多，尤其多藥耐藥結核病（MDR－TB）和超級耐藥結核病（XDR－TB）的出現使得對新型抗結核藥物的需求更加迫切［1］。

噬菌體是一種能特異性感染細菌、在宿主體內進行復制和繁殖的病毒，是地球上最豐富的物種［2］，幾乎有細菌生存的環境就存在有相應的噬菌體［3］。噬菌體可以通過在感染周期末編碼合成細胞壁水解酶（lysins）來裂解宿主菌釋放子代噬菌體［4］。噬菌體裂解酶作為一種新型殺菌制劑，與抗生素相比，它具有使用劑量小，特異性強等優點［5］。然而，噬菌體裂解宿主不僅需要裂解酶還需要另一種蛋白—穿孔素（Holin）。Holin蛋白是噬菌體基因編碼的小分子膜蛋白，可以在宿主菌細胞膜上形成跨膜孔，這個“孔洞”是噬菌體裂解酶穿過細胞膜到達細胞壁破壞肽聚糖的通道［6］。Holin蛋白不僅是構成跨膜孔的重要元件，還是觸發細菌裂解的“分子定時器”，在噬菌體的裂菌過程中扮演著關鍵角色［7］。

本研究以分枝桿菌噬菌體CJAUS5基因組為模板，克隆了holin基因，并進行了序列分析，為進一步研究Holin蛋白的生物學特性、功能及探討其潛在的應用價值奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒 噬菌體CJAUS5由本實驗室分離鑒定并保存；E.coliDH5α感受態細胞（由本實驗室制備并保存）；克隆載體pMD19－T（購于大連寶生物工程有限公司）。

1.2 試劑 限制性核酸內切酶（BamHI、EcoRI）、ExTaq DNA聚合酶、T4DNA連接酶（大連寶生物工程有限公司）；Tris、EDTA（BBI公司）；氨芐青霉素、瓊脂（北京鼎國生物工程公司）；7H9液體培養基（BD醫療器械有限公司）；質粒小提試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；凝膠回收試劑盒（杭州維特潔生化技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成 根據GenBank中登錄的分枝桿菌肌尾噬菌體Ava3（GenBank：JQ911768.1）和Drazdys（GenBank：JF704116.1）的holin基因序列設計引物，送生工生物工程（上海）有限公司合成，引物序列如下：上游P1：5’－GCAGGATCCAT?GAAGTACTCACCCGC－3’，劃線部分為BamH I酶切位點；下游P2：5’－CGGAATTCTCATCGCTTCAA? CACGGA－3’，劃線部分為EcoR I酶切位點。

1.3.2 PCR反應體系和反應條件 反應體系：CJAUS5噬菌體基因組模板DNA2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，2.5 mmol／L dNTP2.0 μL，ExTaq酶0.3 μL，10×ExTaq buffer 2.5 μL，ddH2O17.2 μL，總體積25 μL。反應條件：94℃預變性10 min，95℃變35 s，64℃退45 s，72℃延40 s，30個循環，72℃再延伸10 min。擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的條帶。

1.3.3 PCR產物的克隆與鑒定 按凝膠回收試劑盒說明書回收純化PCR產物，將其與pMD19－T載體連接，再將連接產物轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，按索萊寶質粒小提試劑盒說明書提取質粒后，經PCR、雙酶切鑒定重組質粒pMD19－T－holin的正確性。

1.3.4Holin基因的測序與分析 將鑒定正確的陽性重組克隆質粒pMD19－T－holin送至生工生物工程（上海）有限公司測序。測序結果應用BLAST軟件與GenBank中同源性較高的毒株相應序列進行比對及相關功能分析；利用DNAStar中MegAlign功能建立系統發育樹，分析序列之間的同源性；運用DNAStar軟件對Holin蛋白進行蛋白特性預測；運用在線分析程序ProtScale分析Holin蛋白的親疏水性；運用在線工具TMHMM Server 2.0分析Holin蛋白的跨膜區；利用蛋白質三級結構在線預測工具I－TASSER預測Holin蛋白可能形成的三級結構。

2 結果與分析

2.1holin基因的擴增 以分枝桿菌噬holin菌體CJAUS5基因組DNA為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見1條約400 bp左右的DNA片斷（圖1），與試驗預期的目的DNA片斷大小相一致。

圖1 CJAUS5的holin基因PCR擴增結果

2.2 擴增產物的克隆與雙酶切鑒定 PCR擴增產物用試劑盒純化后，與pMD19－T載體連接，轉化至E.coliDH5α，少量提取質粒用EcoR I和BamH I進行雙酶切鑒定。電泳結果表明，重組質粒分別被酶切成兩條帶，一條約為2700 bp，與pMD19－T空載體大小吻合，另一條約400 bp左右，與holin基因擴增片段大小一致（圖 2）。說明克隆載體pMD19－T－holin構建成功。

2.3holin基因的序列測定與同源性分析 測序結果表明，去除酶切位點和保護堿基后，分枝桿菌噬菌體CJAUS5的holin基因大小為411 bp，可編碼136個氨基酸。用BLAST軟件對測序結果進行同源性分析發現，所得序列與GenBank中已知分枝桿菌肌尾噬菌體holin序列相似性高達 99.03%～99.51%，編碼的氨基酸序列同源性高達 99%～100%，其中 MBP－Ghost（GenBank：JF704096.1）、MBP－Nappy（GenBank：JN699627.1）、MBP－Drazdys（GenBank：JF704116.1、MBP－ArcherS7（GenBank：KC748970.1）的holin基因與 CJAUS5噬菌體的holin基因同源性最高，達99.51%。運用MegAlign軟件構建系統發育樹（圖3）發現，CJAUS5的holin基因與大多數分支桿菌肌尾噬菌體的holin基因處于同一分支，說明CJAUS5的holin基因與它們親緣關系較近。

圖2 陽性重組質粒pMD19－T－holin的雙酶切鑒定結果

圖3 CJAUS5的holin系統進化樹

2.4 Holin的蛋白的特性預測 應用DNAStar軟件的protean功能對CJAUS5的holin基因編碼的蛋白進行蛋白特性預測，結果表明：Holin蛋白相對分子質量為13802.07，等電點為5.77；整個蛋白中酸性氨基酸出現的頻率為8.09%，堿性氨基酸出現的頻率為7.35%，極性氨基酸出現的頻率為18.38%，疏水氨基酸出現的頻率為50.74%，蛋白在pH＝7.00時帶 0.92個單位的負電荷；其二級結構中（Gmier分析方法）α－螺旋占37.50%，β－折疊占58.10%，轉角和無規則卷曲占5.15%（圖4）。

圖4 CJAUS5－Holin蛋白特性預測

2.5 CJAUS5－Holin蛋白的親疏水性分析 運用在線分析程序ProtScale分析Holin蛋白的親疏水性，結果發現該蛋白大約在11～26、40～58位氨基酸之間含有典型的疏水性區域（圖5）。

圖5 CJAUS5－Holin蛋白親疏水性分析

2.6 CJAUS5－Holin的跨膜區分析 Holin蛋白根據其拓撲異構學的不同可劃分為三類，最大的兩類是第I類和第Ⅱ類，其中第I類有3個跨膜結構域（transmembrance domain，TMD）；第Ⅱ類有 2個TMD。第I類和第Ⅱ類眾多不相關基因家族中，有一種基因家族的T4穿孔素gpt和與它有親緣關系的T－偶數噬菌體的相關穿孔素被歸為第Ⅲ類，它們只有1個TMD［8］。運用在線網絡工具分析TM?HMM Server 2.0分析Holin蛋白的跨膜區，結果顯示Holin蛋白的1～6、59～136位氨基酸處于胞內部分，27～35位氨基酸處于胞外部分，7～26、36～58位氨基酸之間形成了兩個典型的跨膜螺旋區（圖6），說明分枝桿菌噬菌體CJAUS5的Holin蛋白屬于第Ⅱ類。

圖6 CJAUS5－Holin跨膜區域分析

2.7 CJAUS5－Holin的三級結構預測 利用蛋白質三級結構在線預測工具I－TASSER對CJAUS5噬菌體Holin蛋白進行三級結構的可能性預測，結果見下（圖7）。

2.8 CJAUS5－holin的核苷酸保守區域分析 應用NCBI中的BLAST工具對CJAUS5噬菌體holin的核苷酸序列進行保守區域分析，結果顯示CJAUS5的holin核苷酸序列含有 PRP38_assoc超家族pfam06495保守區域，該區域為植物和后生動物前體mRNA剪接因子38相關的C端親水性區域。

圖7 CJAUS5－Holin三級結構預測

圖8 CJAUS5－holin保守區域分析

3 討論

研究成功克隆了分枝桿菌噬菌體CJAUS5的holin基因，通過BLAST比對軟件發現它與GenBank中其它分枝桿菌肌尾噬菌體相關基因的核苷酸及氨基酸序列同源性很高，說明該基因序列非常保守；系統進化分析表明CJAUS5－holin與大多數肌尾噬菌體的holin基因處于同一分支，這說明CJAUS5的holin基因與它們有較近的親緣關系；對Holin蛋白進行親疏水性，發現該蛋白大約在11～26、40～58位氨基酸之間含有典型的疏水性區域；跨膜區分析結果顯示，Holin蛋白1～6、59～136位氨基酸處于胞內部分，7～26、36～58位氨基酸之間形成了兩個典型的跨膜螺旋區，結合其疏水性區域走向，可以看出CJAUS5－Holin蛋白為跨膜蛋白；核苷酸序列保守區域分析結果發現，CJAUS5－Holin核苷酸序列含有植物和后生動物前體mRNA剪接因子38相關的C端親水性區域（PRP38_assoc超家族），其走向與 Holin蛋白的胞內部分吻合。由此可以說明CJAUS5－Holin蛋白是一個具有保守的親水性C端和兩個跨膜區域的膜蛋白，屬于第Ⅱ類Holin蛋白。這一結果與已知的分枝桿菌噬菌體Ms6－Holin樣蛋白的分析結果一致［9］。

雙鏈DNA噬菌體普遍采用穿孔素－裂解酶模式（holin－lysin system）降解細菌細胞壁，釋放出子代噬菌體。其中能為裂解酶穿過細胞膜到達細胞壁提供“通道”的跨膜蛋白Holin具有非常重要的作用。與傳統意義上的跨膜蛋白不同，Holin蛋白是由宿主體內的噬菌體基因編碼而成的，噬菌體裝配階段，Holin蛋白分子在宿主細胞膜上積聚并且這一過程不會對宿主造成可察覺的影響，然后在一個特定時間，形成它們的一級結構，從而引發宿主細胞膜局部破裂［10］。許多噬菌體在編碼Holin蛋白的同時，還編碼一個antiholin蛋白，它可以通過抑制Holin蛋白的作用來控制細菌裂解的時間。有時antiholin由具有數個氨基酸延伸形成的雙啟動N端的holin基因編碼，或者由另一個起始密碼子翻譯表達［11］，有時由一個獨立基因編碼［12］。

近年來，關于分枝桿菌噬菌體的研究發展迅速。截止目前共有5846株分枝桿菌噬菌體登錄在相應網站上，其中有800株進行了全基因測序，登錄到GenBank的有428株，而這些噬菌體中39.94%是2013年以來發現的，說明本領域的研究日益受到人們的重視。我國也有研究者從事該方面工作，但對holin基因的具體研究在國內尚未見報道［13］。本研究克隆的分枝桿菌噬菌體holin基因及其基因序列編碼的蛋白分析，為進一步研究分枝桿菌噬菌體裂解宿主的機制奠定了基礎。

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（編 輯：陳 希）

Cloning and Sequence Analysis of Mycobacteriophage CJAUS5 StrainholinGene

JIANG Yi－qian1，2，QI Yu1，LIU Wen－xian1，2，JIANG Xiu－yun1，3，GAO Yun－hang1，2，XU Feng－yu1，2?

（1.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；2.Key Laboratory of Animal Production，Product Quality and Security，Ministry of Education of the people’s Republic of China，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；3.College of Life Science，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China）

In order to further research the mechanisms of phage lysis host bacteria and develop the value of phage lysis related protein.Specific primers were designed based on theholingene sequences of mycobacteriophage deposited in GenBank target segment（about 411 bp in length）was amplified by PCR with Mycobacteriophage CJAUS5 genome as a template.The segment was cloned into pMD19－T vector and sequencing the positive recombinant plasmid pMD19－T－holinafterBamHI andEcoRI digestion.The results show thatholingene was successfully cloned and 99.03%to 99.51%sequence homology with other myoviridae mycobacteriophages’sholingene and 99%to 100%amino acid homology.The analysis results of the protein encoded byholingene show that it is a protein with a hydrophilic carboxy－terminal domain and two potential transmembrane domains.This research successfully cloned theholingene of mycobacteriophage CJAUS5 and analyzed the amino acid sequence which laid the foundation for the futher study of Holin protein.

2015－02－02

A

1002－1280（2015）04－0001－06

Q78

吉林省科技廳項目（20140204069NY）

蔣依倩，碩士，從事動物微生態制劑研究。

徐鳳宇。E－mail：Xvfengyv2002＠126.com