雞樹條莢蒾生長期不同部位綠原酸含量變化分析

冀樹伸，朱伯強，符林春(廣州中醫藥大學 熱帶醫學研究所，廣東廣州 510405)

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雞樹條莢蒾生長期不同部位綠原酸含量變化分析

冀樹伸，朱伯強，符林春*
(廣州中醫藥大學 熱帶醫學研究所，廣東廣州 510405)

目的：采用高效液相色譜法(HPLC)測定雞樹條莢蒾生長期不同部位綠原酸含量，為其資源合理利用提供科學依據。方法：采用VP-ODS C18(4.6mm×150mm，5μm)色譜柱，以乙腈∶0.4%磷酸(17∶83)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為327nm。果實和葉片的綠原酸提取液經0.22μm濾膜過濾后直接進樣, 進樣量為20μL。結果：綠原酸濃度在0.01～54.0μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系(r=0.999 7)。8月果實中綠原酸含量最高，為49.35μg/mL。結論：雞樹條莢蒾生長期果實中綠原酸含量變化顯著，且8月份積累最多。

雞樹條莢蒾；綠原酸；高效液相色譜法；含量測定

雞樹條莢蒾(ViburnumsargentiiKoehne)系忍冬科莢蒾屬植物，又名天目瓊花，民間作“雞樹條”藥用[1]。為落葉灌木，分布于遼寧、吉林、黑龍江、內蒙古、山東、河北、四川、浙江等地，朝鮮、日本、前蘇聯也有分布，其天然資源極為豐富[2-3]。雞樹條莢蒾所含的有效成分綠原酸具有廣譜抗病毒、抗菌、抗炎等藥理作用[4]，對消化系統、血液系統和生殖系統均有療效，同時又是很多中藥現代制劑如雙黃連注射液、雙花注射液的原料[5]。本實驗利用高效液相色譜法(HPLC)測定雞樹條莢蒾生長期不同部位綠原酸含量，并分析了不同時期不同部位綠原酸含量的變化，以期為合理利用藥用植物資源提供依據。

1 材料及方法

1.1 材料

本試驗選擇長勢一致的雞樹條莢蒾植株，在其展葉期以及果實轉色期，采摘大小一致、方向相同、長勢相近的葉片與果實，放陰涼處陰干至恒重，用粉碎機粉碎，備用，采樣時間為7月5日、7月15日、7月25日、8月5日、8月15日。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀(島津LC-20AT)，電子分析天平(梅特勒)，KQ3200DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，中藥粉碎機(溫州LG-08A)，水浴鍋(金壇市醫療儀器廠HH-S4)，SHB111循環水式多用真空泵，高速冷凍離心機，旋轉蒸發儀(步琪)。

綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號 110753-200212)、95%乙醇(分析純)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、磷酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、石油醚(分析純)。

1.3 綠原酸的提取

將干燥的雞樹條莢蒾果實用研缽研碎，稱取4.0g，用石油醚脫脂，之后加乙酸乙酯40mL，超聲提取30min,提取2次，控制溫度在35 ℃左右。過濾，合并濾液，定容于80mL。用旋轉蒸發儀蒸餾，用色譜甲醇定容于5mL。將提取溶液用0.22μm濾膜過濾，取20μL上樣。將干燥的雞樹條莢蒾葉用研缽研碎，稱取10.0g，用石油醚脫脂，之后加乙酸乙酯100mL，超聲波提取30min，提取2次，控制溫度在35℃左右。過濾，合并濾液，定容于200mL。用旋轉蒸發儀蒸餾，用色譜甲醇定容于5mL。將提取溶液用0.22μm濾膜過濾，取20μL上樣[6-13]。

1.4 色譜條件

色譜柱：VP-ODS C18柱(4.6mm×150mm)；流動相：乙腈∶0.4%磷酸(17∶83)；流速：1mL·min-1；0.45μm濾膜

抽濾，等梯度洗脫，進樣量：20μL；柱溫：室溫；檢測波長：327nm；靈敏度0.5AUFS[6]。

1.5 精密度試驗

在上述色譜條件下，精密吸取1.00mg·L-1對照品溶液20μL，重復進樣6次，求得對應的綠原酸含量，得RSD為1.90%，說明綠原酸較為穩定。

1.6 重復性試驗

取同一時期果實中綠原酸提取液共5份，進樣測定。求得對應的綠原酸含量，計算其含量的RSD值為1.16%，說明綠原酸在樣品中較為穩定。

1.7 標準曲線繪制

將綠原酸標準品4.6mg溶于甲醇中，定容至50mL容量瓶中，配制成0.092mg·mL-1的標準儲備液。從標準儲備液中吸取3、5、7、9、11mL用甲醇稀釋至25mL容量瓶中，用0.22μm濾膜過濾，取10μL上樣。以綠原酸濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，繪制標準品的標準曲線[6-13]。

圖2 綠原酸標準曲線

1.8 數據處理方法

采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，組間數據比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 標準品高效液相色譜

用高效液相色譜法，在規定的色譜條件下進行測量，用標準品溶液確定綠原酸色譜峰的保留時間，標準品的高效液相色譜見圖1，綠原酸標品的保留時間為4.190min。

圖1 綠原酸標準品的HPLC色譜

2.2 綠原酸標準曲線繪制

濃度為54.000μg/mL、27.000μg/mL、13.500μg/mL的標準品溶液用高效液相色譜法繪制標準曲線。以綠原酸濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸分析，繪制標準品的標準曲線，得到回歸方程Y= 416 74.06X-0.012, 相關系數r=0.999 701 0，說明綠原酸濃度在0.01～54.000μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。標準曲線見圖2。

2.3 樣品中綠原酸含量的測定

測得7月5日、7月15日、7月25日、8月5日、8月15日雞樹條莢蒾果實和葉片中綠原酸的峰面積與其相對應的質量濃度見表1。由t檢驗得知，t=5.004>t0.01(4)，則P<0.01，即果實與葉片的綠原酸含量有極顯著差異，雞樹條莢蒾果實中綠原酸的含量明顯高于葉片中綠原酸的含量。

表1 雞樹條莢蒾生長期的果實和葉片中綠原酸含量變化

2.4 生長期綠原酸含量變化分析

測得7月5日、7月15日、7月25日、8月5日、8月15日雞樹條莢蒾果實和葉片中綠原酸質量濃度后，分析比較雞樹條莢蒾不同時期果實和葉片中綠原酸含量變化，見圖3。

圖3 生長期雞樹條莢蒾中綠原酸含量變化

3 討論

從圖3可以看出，生長期雞樹條莢蒾果實中綠原酸含量呈現先增長后下降再增長再下降的趨勢。從7月5日至7月15日較快增長，含量接近最高，為48.122μg/mL；7月15日至7月25日緩慢下降；7月25日至8月5日又緩慢增長，含量達到最高，為49.352μg/mL；8月5日至8月15日又較快下降。生長期雞樹條莢蒾葉中片綠原酸含量都較

低，變化趨勢不明顯。

從生長期雞樹條莢蒾中綠原酸含量變化來看，果實中綠原酸含量在7月15日較高，為48.12288μg/mL，在8月5日達到最高，為49.35275μg/mL。葉片中綠原酸含量在7月15日達到最高，為0.3543μg/mL。果實中綠原酸含量與葉片中有極顯著差異，果實>葉片，而且生長期果實中綠原酸含量變化比較顯著。因此8月為最佳采收時期，能充分利用雞樹條莢蒾果實中積累的綠原酸。

[1] 祝之友.莢蒾的臨床應用與本草學研究[J].時珍國醫國藥,1997,8(1):4.

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[3] 祝之友.莢蒾屬植物資源調查及開發利用[J].基層中藥雜志,1999,13(1):24.

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[5] 高錦明.綠原酸分布,提取與生物活性研究綜述[J].西北林學院學報,1999,14(2):73-82.

[6] 趙權.脫落酸對長白忍冬果實和葉綠原酸含量的影響[J].北方園藝,2011(22):22-24.

[7] 袁宏偉.HPLC法測定雞樹條莢蒾果實中綠原酸的含量[J].現代醫藥衛生, 2010,26(19):2887-2888.

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[11] 恒華.雞樹條莢迷果實中綠原酸的含量測定[J].黑龍江醫藥,2007,4(12):125

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[13] 于加平,上夕宇,馬中宇.雞樹條莢迷果實中綠原酸的提取及含量測定[J].安徽農業科學,2006(3):28.

(責任編輯：宋勇剛)

The Content Change Analysis of Chlorogenic Acid in Different Part ofViburnumsargentiiDuring the Different Growing Time

Ji Shushen, Zhu Boqiang, Fu linchun*
(Tropical Medicine Institute, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China)

Objective:To determine the content of chlorogenic acid in different part ofViburnumsargentiiduring the different growing time by high-performance liquid chromatography (HPLC) and provide a scientific basis for reasonable utilization of the herb.Methods:All samples were determined by VP-ODS C18column (150mm×4.6mm, 5μm) at UV 327 nm wavelength, using acetonitrile-0.4% phosphoric acid as the mobile phase at a flow rate of 1.0mL/min. The determination of extracting solution from the fruit and leaves of the herb was carried out by direct injection after 0.22μm micropore filter and the injection sample size was 20μL.Results:The calibration curve was linear within the range of 0.01～54.0 μg/mL (r=0.999 7)。In August, the content of chlorogenic acid from the fruit of Viburnum sargentii was 49.35ug/mL and reached the highest concentrations.Conclusion:The content of chlorogenic acid from the fruit ofViburnumsargentiivaried significantly during the different growing time and reached the highest concentrations in August.

ViburnumsargentiiKoehne; Chlorogenic Acid；HPLC; Determination of Content

2015-01-15

冀樹伸(1988-),男, 廣州中醫藥大學碩士研究生，研究方向為中醫藥防治病毒性疾病。

符林春(1957-)，男，廣州中醫藥大學教授，博士生導師，研究方向為中醫藥防治病毒性疾病。

R284.2

A

1673-2197(2015)11-0034-03

10.11954/ytctyy.201511014