抗瘧中草藥篩選及其有效部位研究

周澤琴，張雄飛，胡梁及，蔡 興，鐘娜娜，朱盛山

(廣東藥學院 中藥開發(fā)研究所，廣東 廣州 510006)

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抗瘧中草藥篩選及其有效部位研究

周澤琴，張雄飛，胡梁及，蔡 興，鐘娜娜，朱盛山*

(廣東藥學院 中藥開發(fā)研究所，廣東 廣州 510006)

目的：為尋找新的有效抗瘧藥物提供實驗依據(jù)。方法：建立伯氏瘧原蟲鼠瘧實驗模型，比較常山復方、金牛草、山豆根、鵝不食草、常山、仙鶴草、青蒿等藥物的50%醇提取物抗瘧活性，比較抗瘧活性最強醇提取物中不同萃取部位對瘧原蟲的抑制效果。結(jié)果：常山復方的50%醇提取物瘧原蟲抑制率為83.46%，高于青蒿藥材的67.33%，抗瘧效果比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；常山復方的50%醇提取物乙酸乙酯萃取部位對瘧原蟲的抑制率達93.78%，與青蒿素的95.92%接近。結(jié)論：常山復方乙酸乙酯萃取物具有顯著的抗瘧活性，可作為抗擊瘧疾的候選藥物。

抗瘧；常山復方；伯氏瘧原蟲；抑制率

自上世紀50年代開始，常山具有抗瘧效果已有報道[1-2]。解放初期，由于奎寧系列抗瘧藥物供不應求、價格昂貴等原因，常山作為抗瘧代用藥物開始在臨床使用，并取得了良好效果。例如，湖北省麻城縣的352 100例瘧疾患者服用常山藥物，治療后普查復發(fā)率僅為0.004 8%[3]。中醫(yī)認為，瘧疾乃肝脾同病，需肝脾同治[4-5]。本文選用常山復方，以常山截瘧為主，輔以柴胡等中草藥疏肝散瘀，養(yǎng)風木、培中土，共復健運之本。大量研究報道[6-7]表明，仙鶴草主要抗瘧活性物質(zhì)為脂溶性酚類成分。湖南省寧鄉(xiāng)縣衛(wèi)生院以金牛草煎劑對抗瘧疾，效果顯著[8]。許昌地區(qū)五十一種中草藥抗鼠瘧實驗報告顯示，山豆根、鵝不食草等中草藥醇提物具有顯著的抗瘧活性[9]。本研究以伯氏瘧原蟲感染小鼠為動物模型，針對各地報道的抗瘧單方、驗方和民間草藥進行抗瘧活性評價，為尋找新的抗瘧藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級昆明小鼠(許可證號：syxk-粵2013-0020)，標準體重(20±2)g，共86只，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 鼠瘧原蟲

伯氏瘧原蟲蟲株K173(Plasmodium berghei k173,P.b.k173)，由廣州中醫(yī)藥大學科技園提供。

1.3 試劑及儀器

青蒿素Artemisinin,ART(廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司，批號：100651，含量：100.3%)；蒸餾水、吉氏染液、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、乙醇等均為分析純。

光學顯微鏡(B205，重慶奧特光學儀器有限公司)、電子天平(BT211B，德國Sartorius公司)、載玻片、細胞計數(shù)板、手掀計數(shù)器、注射器、載玻片、剪刀、鑷子等。

1.4 樣品制備

1.4.1 青蒿素溶液制備 精密稱取青嵩素15.5mg,置于研缽內(nèi)研磨成細粉末狀,加入0.5%的羧甲基纖維素鈉生理鹽水5mL,繼續(xù)研磨,制成濃度為1.24mg/0.4mL的藥液，置4℃冰箱冷藏備用。

1.4.2 中草藥提取物 分別取常山復方、金牛草、山豆根、鵝不食草、常山、仙鶴草、青蒿各500g，粉碎，過篩，以10倍量50%的乙醇提取2次,每次1h，減壓回收乙醇，濃縮至稠膏，得粗提物；將常山復方粗提物與蒸餾水混懸，依次用乙酸乙酯、石油醚、氯仿、正丁醇萃取至有機層無色，回收有機溶劑，冷凍干燥，得到常山復方的乙酸乙酯提取物、石油醚提取物、三氯甲烷提取物、正丁醇提取物，各提取部位密封置4℃冰箱冷藏備用，臨用前用0.5%的羧甲基纖維素鈉稀釋至所需濃度。

1.5 伯氏瘧原蟲鼠瘧模型建立

取伯氏瘧原蟲常規(guī)株，復蘇后接種3只健康小鼠,每只腹腔注射0.2mL感染血液,作為血傳第一代；接種后5天，血傳3只健康小鼠，作為血傳第二代；接種后5天,將待試驗小鼠稱重隨機分組，雌雄各半，并分別血傳接種試驗小鼠,即為伯氏瘧原蟲常規(guī)鼠瘧模型[10]。

1.6 分組及給藥方法

將78只已感染瘧原蟲小鼠隨機分為13組，每組6只，分別為模型組、青蒿素對照組、常山醇提物用藥組、金牛草醇提物用藥組、鵝不食草醇提物用藥組、山豆根醇提物用藥組、仙鶴草醇提物用藥組、青蒿醇提物用藥組、常山復方醇提物用藥組、常山復方三氯甲烷萃取物用藥組、常山復方正丁醇萃取物用藥組、常山復方乙酸乙酯萃取物用藥組、常山復方石油醚萃取物用藥組。用藥組小鼠給予相應中藥材醇提物飼養(yǎng)，模型組給予等體積生理鹽水。3～4h后按1.365g/kg標準灌胃給首劑藥，連續(xù)給藥4天。

1.7 制片與鏡檢

于小鼠尾部取約1μL的血量，制血膜，編號。甲醇固定，待干后用吉氏染液染色25min，清水細流沖洗干凈、晾干。鏡檢50個油鏡視野(相當于2×104紅細胞(RBC))未見原蟲者為陰性；原蟲感染率<1%，計算104個RBC；感染率1%～10%，計算103個RBC；感染率10%以上，計算500個RBC。通過油鏡計算紅細胞感染瘧原蟲的百分數(shù)、感染率及抑制率，計算公式如下：

感染率=(感染紅細胞數(shù)/紅細胞總數(shù))×100%

抑制率=(模型組RBC感染率-用藥組平均RBC感染率)/模型組RBC感染率×100%

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 不同中草藥醇提物抗瘧效果比較

在選取的7種藥物中，以常山復方醇提物用藥組抗瘧效果最佳，對感染伯氏瘧原蟲小鼠的紅細胞抑制率可達83.46%，青蒿、常山及仙鶴草用藥組分別為67.33%、65.76%、65.03%，山豆根、金牛草、鵝不食用藥組抗瘧效果相當，為55%～60%。與模型組比較，7種藥材用藥組均有顯著的抗瘧活性(P<0.05)；常山復方抗瘧效果優(yōu)于青蒿用藥組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；常山用藥組與青蒿用藥組抗瘧效果無顯著性差異(P>0.05)；金牛草、鵝不食草、山豆根、仙鶴草等用藥組抗瘧效果均低于青蒿用藥組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同中草藥醇提物抗瘧效果比較 ±s，n=6)

注：與模型組比較，*P<0.05；與青蒿醇提物對照組比較，▲P<0.05。

2.2 常山復方提取物不同提取部位抗瘧效果比較

在上述實驗基礎上，選取抗瘧效果最佳的常山復方進一步篩選抗瘧有效部位。與模型組比較，常山復方的乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、三氯甲烷提取物、石油醚提取物用藥組均有顯著的抗瘧活性(P<0.05)。其中，乙酸乙酯提取物對感染伯氏瘧原蟲小鼠紅細胞抑制率達93.78%，僅略低于青蒿素對照組的95.92%，明顯優(yōu)于正丁醇提取物、三氯甲烷提取物、石油醚提取物用藥組，其他三組提取物抑制率分別為70.99%、62.30%、18.95%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 常山復方提取物不同提取部位抗瘧效果比較 ±s，n=6)

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.3 不同藥物對小鼠感染瘧原蟲紅細胞的影響

被瘧原蟲寄生的紅細胞出現(xiàn)脹大，甚至形變，胞質(zhì)致密，色深藍，幾乎充滿被寄生的紅細胞內(nèi)，棕褐色瘧色素散在。在光學顯微鏡油鏡視野下，被瘧原蟲感染的紅細胞數(shù)量從小到大依次為青蒿素對照組、常山復方乙酸乙酯萃取物用藥組、常山復方醇提物用藥組、常山醇提物用藥組、模型對照組。見圖1。

圖1 不同藥物對小鼠感染瘧原蟲紅細胞的影響

3 討論

目前，我國青蒿產(chǎn)量少,且青蒿素含量低,青蒿素類藥物的商品價格較高。在瘧疾高發(fā)的非洲地區(qū)，大部分國家經(jīng)濟、醫(yī)療衛(wèi)生水平普遍較低,多數(shù)瘧疾患者可應用青蒿素類藥物的概率依然較小,全球抗瘧形勢仍不容樂觀[11]。在選取的7種抗瘧藥物中，以常山復方抗瘧效果最佳，青蒿、常山次之，金牛草、鵝不食草、山豆根、仙鶴草效果較差。其中，常山復方的乙酸乙酯提取部位抗瘧效果最優(yōu)。據(jù)記載，常山有截瘧劫痰之效，可用于解熱、抗阿米巴、除痰、瘧疾等[3，12]。本實驗證實常山抗瘧效果明顯，但以常山為主的復方抗瘧效果更佳，優(yōu)于青蒿藥材；且常山復方的乙酸乙酯萃取部位抗瘧效果與青蒿素相當。在青蒿素耐藥性日益顯現(xiàn)、價格高居不下的情況下，尋找常山復方藥材提取物的抗瘧活性成分，闡明其作用機制，應用前景較大。

[1] 趙承嘏,謝毓元.常山葉中之抗瘧質(zhì)素[J].中國科學,1951(4):455-457.

[2] 村田清志.常山的抗瘧作用[J]. 國外醫(yī)學·中醫(yī)中藥分冊,1998,20(5):61-62.

[3] 中共湖北省委除害滅病辦公室.使用中藥常山抗瘧的經(jīng)驗[J]. 中醫(yī)雜志,1959,1(4):35-37.

[4] 柳寶怡．柳寶怡醫(yī)案[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1981:57.

[5] 柳寶怡．增評柳選四家醫(yī)案[M].南京:江蘇科學技術出版社,1983:272.

[6] 洪閣,戴永紅,劉培勛,等.仙鶴草化學成分和藥理作用研究進展[J].藥學服務與研究,2008,8(5):362-366.

[7] 黃蘭孫.廿年來抗瘧藥物化學研究進展(續(xù))[J].藥學學報,1983,20(8):633-639.

[8] 宋大仁.介紹幾種防治瘧疾的速效療法[J].江西中醫(yī)藥,1959,8(8):17-19.

[9] 王順祥,陳松枝,韓勇,等.許昌地區(qū)五十一種中草藥抗鼠瘧實驗初步報告[J].河南預防醫(yī)學雜志,1980,8(4):12-19.

[10] 孫雪英. 復方蒿甲醚對伯氏瘧原蟲青蒿素抗性鼠瘧療效與其它抗瘧藥療效比較的研究[D].成都:成都中醫(yī)藥大學,2013.

[11] 王順祥,李書迠. 抗瘧中草藥青蒿的研究[J].河南預防醫(yī)學雜志,1978,6(2):20-29.

[12] 趙燦熙. 常山提取物對氯喹敏感株和抗氯喹株鼠瘧原蟲的效應觀察[J]. 同濟醫(yī)科大學學報, 1986(2):129-132.

(責任編輯：李嵐春)

Screen The Antimalarial Chinese Medicinal Herb and Research its Effective Parts

Zhou Zeqin，Zhang Xiongfei，Hu Liangji，Cai Xing，Zhong Nana，Zhu Shengshan*

(Research and Development Institute of Chinese Materia Medica, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

Objective:For finding new, effective antimalarial medicines and provide experimental bases.Methods:The experimental models were established by mice infected with Plasmodium berghei. Compare the antimalarial activity of 50% ethanol extracts of compound Dichroa febrifuga Lour，Polygala arvensis Willd，Radix Sophorae Subprostratae，Centipeda minima，Dichroa febrifuga Lour，Agrimonia pilosa，Artemisia apiacea. Picked out the highest reactive ethanol extracts :compound Dichroa febrifuga Lour. Then, compare the suppression effect on plasmodium from its different extractive fractions.Results:The plasmodium inhibition of 50% ethanol extracts of compound Dichroa febrifuga Lour and Artemisia apiacea were 83.46% and 67.33%, respectively , which had statistical significance (P< 0.05); The plasmodium inhibition of ethyl acetate extracts of compound Dichroa febrifuga Lour was 93.78% and artemisinin was 95.92%.Conclusion:The ethyl acetate extracts of compound Dichroa febrifuga Lour has significant antimalarial activity,which could be the new candidate antimalarial medicines as a priority.

Antimalarial;Compound Dichroa Febrifuga Lour; Plasmodiumberghei;Inhibition

2015-05-05

周澤琴(1990-)，女 ，廣東藥學院碩士研究生，研究方向為傳統(tǒng)中藥現(xiàn)代化。E-mail: m18826413913@163.com

朱盛山(1957-)，男，廣東藥學院教授，碩士生導師，研究方向為傳統(tǒng)中藥現(xiàn)代化。E-mail: zhush3@126.com

R289

A

1673-2197(2015)16-0006-03

10.11954/ytctyy.201516004