4種紫珠屬藥用植物RAPD多態性分析

楊先國，谷陟欣，盧 捷，劉克明，黃 勝

(1.湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412012；2.九芝堂股份有限公司，湖南 長沙 410021； 3.湖南師范大學 生命科學學院，湖南 長沙 410081)

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4種紫珠屬藥用植物RAPD多態性分析

楊先國1，谷陟欣2，盧 捷2，劉克明3，黃 勝2

(1.湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412012；2.九芝堂股份有限公司，湖南 長沙 410021； 3.湖南師范大學 生命科學學院，湖南 長沙 410081)

目的：運用隨機擴增多態性技術探索4種紫珠屬藥用植物的遺傳多態性，為其種質鑒定提供依據。 方法：采用試劑盒提取法提取裸花紫珠、廣東紫珠、大葉紫珠與杜虹花4種新鮮植物葉中的總DNA，采用經過篩選的20條隨機引物進行PCR擴增。結果：試劑盒可有效獲取4種紫珠植物的總DNA，擴增得到條帶共152條，多態性條帶137條，多態率達到88.2%；聚類分析結果表明，4種紫珠供試材料共分為3類。結論：4種紫珠RAPD擴增后的聚類分析結果與植物形態學觀察分類結果相一致，所得RAPD標記可用于紫珠屬藥用植物的多態性研究，為開發遺傳鑒定的分子標記奠定基礎。

紫珠屬；基因組DNA；RAPD；多態性；聚類分析

紫珠屬植物(CallicarpaLinn)來源于馬鞭草科，我國紫珠屬植物有46種，主要分布于長江以南的廣大地區，如海南、廣東、廣西、云南、貴州、湖南、江西、福建等地。其中約有30多種可以作為藥用，入藥部位為莖葉或全株，其性平、味苦，歸肝、脾、肺經，具有活血止血、清熱解毒等功效，主要用于治療吐血、咳血、便血、崩漏、創傷出血等[1-2]。

紫珠作為一種重要的中藥資源，在我國被廣泛使用。對我國的中藥材地方標準中收載的紫珠品種進行統計可知，我國湖南、廣東、廣西、江西、云南、河南以及山東7個省區的中藥材地方標準收載了近8種紫珠屬藥用植物，其中以裸花紫珠、廣東紫珠、大葉紫珠以及杜虹花為主，現已作為中成藥制劑的原料藥廣泛使用。由紫珠藥材制成的中成藥品種達20多種，其中裸花紫珠為九芝堂股份有限公司生產的裸花紫珠片的主要原料藥[3-4]。但在原料收集過程中，可能有紫珠屬的其他藥材混入到原料藥中，由于紫珠屬植物葉及枝均具有止血、解毒等功效，且原植物藥材性狀極其相似，在市場流通及臨床應用過程中難以鑒別，因而常常相互混用。目前文獻研究主要集中在生藥學鑒定[5-6]、質量標準研究方面[7-11]，仍未從分子水平對常用紫珠屬藥材進行鑒定。本研究采用RAPD分子標記從DNA分子水平對四個紫珠品種展開相關研究，為合理利用紫珠屬藥用植物資源、從DNA分子水平揭示四種紫珠屬藥用植物品種的親緣關系提供科學依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

裸花紫珠CallicarpanudifloraHooker & Amott，廣東紫珠callicarpakwangtungensisChun，大葉紫珠callicarpamacrophyllaVahl，杜虹花CallicarpaformosanaRolfe，由湖南中醫藥高等專科學校彭學著教授鑒定為真品。樣品來源及分類見表1，每種植物均取嫩葉提取基因組DNA，-20℃保存。

1.2 儀器

DYY-2C電泳儀(北京六一儀器廠)，PCR儀MASTERCYCLER(德國Eppendorf)，凝膠成像系統Tanon 1600R(上海天能)，-80℃超低溫冰箱DW-HL538(中科美菱)。

1.3 試劑與引物

廣譜性植物總DNA提取試劑盒(HiPure Plant DNA Kits)購自廣州Magen(美基)生物公司，2×Taq master Mix購自康為世紀，RAPD引物購自上海生工公司產品(見表2)。其他試劑均為分析純。

表1 4種紫珠樣品來源及分類

表2 RAPD分析所用引物

2 方法

2.1 紫珠植物組織DNA提取

采用Magen植物總DNA提取試劑盒標示的使用方法進行提取。采用液氮將植物樣品研磨成粉末，轉移50～100mg 凍藏樣品至 2mL離心管中，立即加入 600μL Buffer PTL/2-Me 和 5μL RNase Solution 至樣品中，劇烈渦旋使樣品充分分散，65°C水浴20min，期間顛倒混勻 2～3次，加入600μL氯仿-異戊醇(24∶1)，渦旋混勻30s，室溫下12 000xg離心5min，轉移上清液至新的離心管中，加入等倍體積 Buffer PBL 至上清液中，渦旋混勻30s，將DNA 柱裝在收集管中，轉移混合液(<700μL)至柱子中，8 000xg離心30～60s。然后按照使用手冊方法進行提取，將提取的 DNA 保存于-20℃下備用。

2.2 PCR擴增及電泳檢測

為獲得穩定的試驗結果，減少實驗過程中因操作導致的實驗誤差，PCR反應體系選擇2×Taq master Mix PCR擴增體系，只需在反應體系中加入DNA模板、引物以及去離子水，主要優化對RAPD影響較大的3個反應參數，即PCR反應體系中的DNA模板濃度(1μL、1.5μL、2.0μL、2.5μL、3.0μL)、引物濃度(0.4μL、0.8μL、1.2μL、1.6μL、2.0μL)、體系循環次數(25、30、35、40、45次)。優化結果表明，DNA模板濃度為2.5μL、引物濃度為2.0μL、循環40次為最佳反應條件。

PCR擴增反應程序：向紫珠RAPD反應的50μL反應體系中加入模板DNA 2.5μL、引物2μL、2×Taq Master Mix 25μL以及去離子水20.5μL。PCR擴增程序為94℃預變性5min，94℃變性30s，36℃退火30s，72℃延伸30s，40次循環，72℃后延伸7min，4℃保存。取擴增產物5μL，在1.5%瓊脂糖凝膠上恒壓(110V)電泳60min，凝膠中含0.5μg/mL溴化乙錠(EB)，采用凝膠成像系統照相。

2.3 數據分析

對擴增后電泳帶總數及多態性條帶數進行統計。將電泳圖譜中的每一條帶(DNA片段)作為一個分子標記，并在模板上有一個結合位點，不同的樣本在凝膠上泳動距離相同則表明其有相同的位點。根據各分子標記的有無得到所有位點的二元數據，有帶記為“1”(強帶和弱帶同記)，無帶記為“0”，采用SPSS17.0軟件進行聚類分析。

3 結果與分析

3.1 基因組DNA電泳檢測

取4種紫珠基因組DNA提取液10μL，在穩壓110V、1.0%瓊脂糖凝膠上電泳60min。基因組DNA 電泳檢測結果表明(見圖1)，通過試劑盒提取的紫珠DNA樣品整齊一致，條帶清晰，沒有出現拖尾與擴散現象，純度較高，因而可以滿足RAPD擴增試驗的要求。

圖1 4種紫珠基因組DNA電泳譜

3.2 RAPD標記多態性分析

20條RAPD引物對4種紫珠屬植物樣本進行擴增得到的條帶的相對分子量主要集中在300～200bp，共擴增得到條帶152條，其中多態性條帶共137條，多態率達88.2%，平均每條引物產生7.6個條帶與6.8個多態性條帶(見表3)，4個樣品的RAPD擴增結果見圖2、圖3、圖4、圖5。

表3 RAPD分析所用引物序列及擴增結果 (n)

3.3 聚類分析

根據擴增條帶，采用SPSS17.0軟件中的Within-groups linkage方法，根據遺傳距離對4個樣本進行聚類分析，繪出紫珠樣本間的RAPD聚類系統圖(見圖6)。從圖6中可以看出，利用RAPD方法可將4個紫珠樣本分為3類，其中杜虹花與廣東紫珠的遺傳距離最近，可歸為一類，大葉紫珠與裸花紫珠各為一類，而大葉紫珠比裸花紫珠在親緣關系上更靠近廣東紫珠與杜虹花。

4 結論

RAPD是建立在PCR基礎上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態性分析的分子標記技術，該技術具有操作簡單、快速，能在短時間內完成對多個樣本研究的特點，被廣泛應用于藥用植物種質資源的遺傳多樣性研究[12-13]、種質鑒定及評價[14-15]、引種馴化[16]和分類學研究等方面[17]。但由于RAPD-PCR的影響因素較多，重復性與穩定性較差，為提高實驗的穩定性與可重復性，本實驗采用2×Taq master Mix PCR混合反應體系，該體系中含有Mg2+、dNTP以及Taq酶濃度等均經過優化，適宜各類植物的擴增實驗。在體系的優化過程中，僅需要對基因組DNA模板的濃度、引物濃度及循環次數等參數進行優化，實驗結果表明，DNA模板濃度為2.5μL、引物濃度為2.0μL、循環40次時，擴增的條帶較多，條帶較清晰。

圖2 裸花紫珠RAPD擴增圖

圖3 廣東紫珠RAPD擴增圖

圖4 大葉紫珠RAPD擴增圖

圖5 杜虹花RAPD擴增圖

圖6 紫珠樣品RAPD聚類分析結果

紫珠屬植物RAPD分析結果表明，20個引物共檢測出152條帶，多態性條帶共137條，多態率達88.2%。從DNA分子水平來說，樣本間遺傳距離越大，說明遺傳分化越大；聚類分析結果表明，4個紫珠屬樣本可分為3類，其中杜虹花與廣東紫珠的遺傳距離最近，大葉紫珠與裸花紫珠各為一類，上述分析結果與紫珠屬植物的生藥學分類相一致。采用RAPD分子標記研究紫珠屬資源之間的遺傳多樣性和親緣關系，對于紫珠屬藥用植物種質資源的遺傳育種、合理利用具有重要意義。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].第1部.北京:人民衛生出版社,1977:588,621.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].第1部.北京:中國醫藥科技出版社,2010.

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(責任編輯：尹晨茹)

Polymorphism of Four Kinds of Medicinal Plants Callicarpa Linn by RAPD

Yang Xianguo1，Gu Zhixin2，Lu Jie2，Liu Keming3，Huang Sheng2

(1.Traditional Chinese Medical College of Hunan，Zhuzhou 412012,China;2.Jiuzhitang Co Ltd,Changsha 410021，China；3.College of Life Science,Hunan Normal University，Changsha 410081,China)

Objective:To research the polymorphism of four kinds of medicinal plants Callicarpa linn by random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis and provide a basis for germplasm identification.Methods:The extraction kit was used to extract the genomic DNA of several plants，including 3 regions of Callicarpa nudiflora Hooker﹠Amott，callicarpa kwangtungensis Chun，callicarpa macrophylla Vahl and Callicarpa formosana Rolfe，then amplified by 20 selected random primers.Results:Extraction kit Was effeetive for 4 Callicarpa linn species genome DNA.With the DNA extracted from several plants as template，20 primers amplified a total of 152 bands，137 bands were polymorphic，polymorphism rate was 88.2%，and the effect amplification was good.The dendogram reflected that 4 samples clustered into three taxa.Conclusion:This result is in accordance with their morphological observed.RAPD markers can be used to analyze polymorphisms of medicinal plants Callicarpa linn，and provide the genetic basis for identification.

Callicarpa Linn;Genomic DNA;RAPD;Polymorphism;Clustering Analysis

2014-11-03

楊先國(1977-)，男，湖南中醫藥高等專科學校講師，研究方向為中藥質量與中藥資源。

R282.6

A

1673-2197(2015)07-0028-04

10.11954/ytctyy.201507014