星點設計—效應面法結合雙指標優化超聲提取黃芩中黃酮苷類成分

蘇建春，柯華香，馬 莉，趙俊霞，孫彩霞，尹蓉莉*，李 化

(1.成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都 611137；2.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700； 3.首都醫科大學 中醫藥學院，北京 100069；4.西華大學 生物工程學院，四川 成都 610039； 5.中國中醫科學院 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700)

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星點設計—效應面法結合雙指標優化超聲提取黃芩中黃酮苷類成分

蘇建春1，2，柯華香2，4，馬 莉3，趙俊霞1，孫彩霞1，尹蓉莉1*，李 化2,5*

(1.成都中醫藥大學 藥學院，四川 成都 611137；2.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700； 3.首都醫科大學 中醫藥學院，北京 100069；4.西華大學 生物工程學院，四川 成都 610039； 5.中國中醫科學院 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700)

目的：采用星點設計—效應面法優化黃芩中黃酮苷類成分的提取工藝。方法：采用UPLC法測定黃芩苷及漢黃芩苷含量，以二者的總評“歸一值(OD)”為因變量，乙醇濃度、提取時間、料液比為自變量，對結果進行多元線性回歸和二項式方程擬合，采用效應面法優化提取工藝，并進行預測分析。結果：最佳提取工藝為58%乙醇，超聲提取45min，料液比為1∶40，OD預測值(0.997)與驗證值(0.991)的偏差小于1%。結論：星點設計—效應面法優選的黃芩中黃酮苷類成分的超聲提取工藝簡便，模型預測性良好，可為探討黃芩中苷類成分提取工藝的研究提供參考。

黃芩；黃芩苷；漢黃芩苷；星點設計—效應面法；超聲提取

黃芩是常用大宗中藥材，為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi.的干燥根，在我國藥用歷史悠久，歷代本草均有記載。其性苦、味寒，歸肺、膽、脾、大腸、小腸經，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等作用[1-2]。黃芩中主要有效成分為黃酮類化合物，包括黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素等[3]。其中黃芩苷和漢黃芩苷是黃芩中主要的黃酮苷類成分，二者含量占黃芩中總黃酮含量的60%以上，是衡量黃芩質量的重要指標成分?，F代藥理研究發現黃芩苷具有抗微生物、抗變態反應、降壓、鎮靜、利膽、保肝和解痙等藥理作用[4]。漢黃芩苷具有抗炎、抗血栓、抗腫瘤等生物活性[5]。

黃芩中黃酮類成分的提取工藝設計常采取正交設計法或均勻設計法優化[6-7]，但這兩種方法是建立在線性數學模型基礎上的工藝優選，精度欠佳。星點設計法采用非線性數學模型進行擬合，復相關系數較高，并在中心點進行重復性實驗，提高了實驗精度，預測值更接近真實值，且操作簡單，實驗次數少。以往的研究多選擇黃芩苷作為評價指標開展黃芩中黃酮最佳提取工藝的優化，忽視了漢黃芩苷作為一個含量較高且活性較強的苷類成分，也是影響黃芩質量的重要指標之一。迄今為止，尚未見到黃酮苷雙指標法優化黃芩提取工藝的研究報道。鑒于此，本文采用超高效液相色譜(UPLC)法快速測定黃芩苷和漢黃芩苷含量，首次以黃芩苷和漢黃芩苷提取率雙指標的總評歸一值為評價指標，采用星點設計法，結合效應面法優選黃芩中黃酮苷類成分的最佳超聲提取工藝，旨在優化提取工藝的同時，為探討星點設計—效應面法應用于黃芩中黃酮苷類成分提取工藝的可行性提供實驗支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY H-Class UPLCTM超高效液相色譜儀(包括四元高壓梯度泵，真空脫氣機，自動進樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器，Empower Ⅱ色譜工作站)；2004 MP6 型半微量電子顯示天平(德國Sartorius公司)；Scout Pro 型電子天平(美國Ohaus公司)；KQ-100DE 型醫用數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，Milli-Q 型超純水制備儀(法國Millipore公司)。

1.2 試藥

對照品黃芩苷(批號E-0050，純度≥98%)，漢黃芩苷(批號E-0664，純度≥98%)購自上海同田生物技術股份有限公司。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；超純水由Milli-Q 純水機制備。黃芩藥材采自河北省灤平縣，經成都中醫藥大學尹蓉莉教授鑒定為唇形科植物黃芩S.baicalensisGeorgi.的干燥根。

2 方法與結果

2.1 黃芩苷和漢黃芩苷UPLC含量測定方法學建立

2.1.1 對照品溶液制備 取適量黃芩苷、漢黃芩苷對照品，加20%乙腈配制成質量濃度分別為64.80μg·mL-1和31.00μg·mL-1的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取黃芩粉末過40目篩，稱取約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中,加入50%乙醇50mL，超聲提取，放冷，過濾，稀釋，定容，取稀釋液過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 UPLC色譜條件 Aquity BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)色譜柱；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫：0～0.5min(82%A)，0.5～2min(82%A～80%A)，2～6min(80%A～70%A)，6～8min(70%A)，8～10min(70%A～40%A)，10～12min(40%A)；柱溫：40℃；流速：0.4mL/min；檢測波長：280nm；進樣體積：1μL。在上述色譜條件下，對照品及黃芩供試品溶液UPLC色譜見圖1。

圖1 黃芩苷對照品溶液(A)、漢黃芩苷對照品溶液(B)、黃芩樣品溶液(C)UPLC圖譜

2.1.4 線性關系考察 分別取“2.1.1”項中對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0μL進樣，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X，μg)為橫坐標進行回歸，繪制標準曲線。得回歸方程，黃芩苷Y=8.632×106X-3.08×104(r=0.999 9)，漢黃芩苷Y=8.194×106X-7.99×103(r=0.999 9)。黃芩苷、漢黃芩苷的線性范圍分別為25.92～389.00ng，12.40～186.00ng。計算最低檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，黃芩苷、漢黃芩苷的LOD分別為1.30ng·mL-1，1.55ng·mL-1(S/N=3)，LOQ分別為3.88ng·mL-1，4.65 ng·mL-1(S/N=10)。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2”項下同一供試品溶液在上述色譜條件，連續進樣6 次，結果顯示黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.82%、0.11%。表明該方法精密度良好。

2.1.6 穩定性試驗 取“2.1.2”項下同一供試品溶液按上述色譜條件分別在0、2、4、6、8、24h進樣分析，黃芩苷、漢黃芩苷峰面積的RSD 分別為0.69%、0.32%。表明供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取黃芩粉末約1.0 g，共6份，精密稱定，按“2.1.2”項下供試品溶液制備方法制樣，在上述色譜條件分別進樣，測定黃芩苷和漢黃芩苷的質量分數。結果顯示，黃芩苷、漢黃芩苷質量分數的RSD 分別為1.95%、1.47%。表明該方法重復性良好。

2.1.8 回收率試驗 取已知含量的黃芩粉末6份，每份約0.05g，精密稱定，分別按樣品中各成分含量的100%加入黃芩苷、漢黃芩苷對照品溶液，按“2.1.2”項下制備方法制備供試品溶液,進樣分析，計算兩種成分的回收率。結果顯示，兩種成分的平均回收率在101.04%～102.98%之間(RSD<4%)(見表1)。表明采用UPLC 測定黃芩苷、漢黃芩苷含量的方法準確性良好。

表1 兩種黃酮苷類成分加樣回收率試驗結果 (n = 6)

2.2 星點設計—響應面法優化乙醇超聲提取條件

2.2.1 實驗設計及結果 通過單因素實驗考察超聲功率、乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比、提取次數對提取工藝的影響，發現提取溫度對黃芩中黃芩苷和漢黃芩苷含量影響較小，結合預實驗結果將提取溫度固定為40℃。因提取次數為非連續變量，回歸處理較困難，結合預實驗結果，固定提取次數為1次，超聲功率40kHz。綜上所述，本試驗采用星點設計方法，選取乙醇濃度X1、提取時間X2、料液比X3為考察因素。根據星點設計的原理，每因素設5個水平，用代碼值-α、-1、0、1、+1、+α表示(三因素星點設計的α=1.732)。因素水平見表2,實驗安排及結果見表3。

表2 星點試驗因素水平

表3 黃芩中黃芩苷及漢黃芩苷提取工藝星點試驗安排及結果

注：15～20號為重復試驗，結果用平均值表示。

2.2.2 數據處理 多指標的數據處理參照文獻報道的總評歸一法[8]。分別測定黃芩苷、漢黃芩苷兩個指標，根據Hassan法將每個指標進行“歸一值”處理，求各指標“歸一值”的幾何均數，即為總評“歸一值”(Overall Desirability,OD)。

dimax=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin) ,OD=(d1d2……dk)1/k(k為指標數)。

2.2.3 效應面法優選工藝條件 因變量曲面圖是三維圖，只能表達兩個自變量的函數，因此固定三個自變量之一為中值，以擬合的目標函數為數學模型，應用Design-Expert8.0.6.1統計軟件繪制因變量三維圖(見圖2-圖4)。由圖2、圖3可知，乙醇濃度是影響黃芩黃酮苷類成分提取的主要因素，且黃芩苷和漢黃芩苷提取率OD值隨乙醇濃度的增大而增加，但增大到一定濃度時，繼續增加乙醇濃度OD值有所下降，說明在一定范圍內乙醇濃度的增大有利于黃芩黃酮苷類成分的提取，可當乙醇濃度繼續增大，極性降低，提取率反而降低。由圖4可知，隨提取時間延長、料液比增加黃芩黃酮苷類成分提取率增加，但增加趨勢不明顯，說明提取時間、料液比對黃芩黃酮苷類成分提取影響較小。

圖2 提取時間與乙醇濃度對OD值影響的三維圖

通過Design-Expert進行最佳提取條件分析，以黃芩苷和漢黃芩苷OD值為考察指標，確定了黃芩中黃酮苷類超聲提取的最佳工藝條件：乙醇濃度為57.89%，提取時間為44.93min，料液比為39.54∶1?？紤]到實際情況，將各因素條件進行微調，最終確定黃芩中苷類成分的最佳提取工藝條件：乙醇濃度為58%，超聲時間為45min，料液比為1∶40，超聲提取1次，提取溫度為40℃。

圖3 料液比與乙醇濃度對OD值影響的三維圖

圖4 料液比與提取時間對OD值影響的三維圖

2.2.4 驗證試驗 按最佳工藝進行3次驗證試驗，黃芩苷、漢黃芩苷含量的實測OD值分別為1.000、0.989、0.991，平均OD值為0.991，與預測OD值0.997的偏差為0.639%，表明所建立的數學模型預測良好，且該工藝條件的重復性也較好。

3 討論

在多指標工藝篩選的試驗設計中，指標間往往相互影響，對某一項指標有利的條件可能不利于另一指標，最終選擇條件往往依據這些指標的綜合效應。本試驗以黃芩苷含量、漢黃芩苷含量為基礎，根據文獻報道換算為總評歸一值(OD)并成功建立數學模型進行優化與數學分析，能充分、全面地反映提取工藝對黃芩中黃酮苷類成分提取的影響。

星點設計是國外常用的一種實驗設計方法，國內在優化中藥提取工藝方面也有應用[9-10]，本文采用星點設計—效應面法對超聲提取黃芩中黃酮苷類成分的工藝進行了探討。由實驗結果可知，星點設計的理論值與實驗值相差較小，采用非線性擬合模型接近客觀事實，通過效應面三維圖觀察因素對指標的影響直觀、方便，且實驗精度高,預測性更好。實驗結果表明星點設計—響應面分析法為優化中藥有效成分提取工藝提供了有效的工具。

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[3] 楊娟，傅軍鵬.黃芩活性成分及藥效研究近況[J].實用醫藥雜志，2004,21(3):271-273.

[4] 張建春，張華，施瑛，等.黃芩苷研究近況[J].時珍國醫國藥，2005,16(3):247-249.

[5] YANG YZ,TANG YZ,LIU YH.Wogonoside?displays anti-inflammatory effects through modulating inflammatory mediator expression using RAW264.7 cells[J].J Ethnopharmacol,2013,148(1):271-276

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[7] 李展，高微微，林文衛，等.均勻設計法優化黃芩提取工藝[J].中草藥，2001,32(7):606-607.

[8] 吳偉，崔光華，陸彬. 實驗設計中多指標的優化: 星點設計和總評“歸一值”的應用[J].中國藥學雜志，2000,35(8):530-533.

[9] LI CP,WANG LL,JIN ZS,et al.Study on the extraction technique of poly-methoxyflavonoids from Citrus peels by using response surface methodology[J].Adv Mater,2012,24(8)：544-547.

[10] 梁晉如，張新新，朱砂等.星點設計—響應效應面法優化山茱萸總苷的提取及純化工藝[J].藥物分析雜志，2013,33(6):1059-1066.

(責任編輯：魏 曉)

Optimization of Ultrasonic Extraction Technology of Flavonoid Glycosides in Scutellaria Baicalensis by the Combination of CCD-RSM and a Two-indicator Model

Su Jianchun1,2，Ke Huaxiang2,4， Ma Li3，Zhao Junxia1，Sun Caixia1，Yin Rongli1*，Li Hua2,5*

(1.Chengdu college of TCM，Sichuan，Chengdu 611137，China；2.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China；3.School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University，Beijing 100069，China；4.Bio-Engineering of College of Xihua University，Sichuan，Chengdu 610039，China;5.State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:To optimize ultrasonic extraction Technology of baicalin and wogonoside in Scutellaria baicalensis by central composite design-reponse surface method(CCD-RSM).Methods:The contents of baicalin and wogonoside were determined by Ultra performance liquid chromatography (UPLC).Independent variables were ethanol concentration, liquid-solid ratio and extraction time, the dependent variable was the overall desirability of extraction rate of baicalin and wogonoside. Linear or no-linear mathematic models were established to estimate the relationship between independent and dependent variables. Response surface methodology was used to optimize the process of extraction. Prediction was carried out through comparing the observed and predicted values.Results:The optimum extraction technology was as following: The extraction time was 45min with solvent to solid ratios (v/w) of 40:1, and the extraction solvent was 58% ethanol at the extraction temperature of 40℃. The deviation between the observed and predicted values was small (P<0.01).Conclusion:This optimized extraction technology was stable and feasible with high predictability.This method can be provided reference for exploring the flavonoid glycosides in Scutellaria baicalensis.

Scutellaria Baicalensis;Baicalin；Wogonoside;Central Composite Design-reponse Surface Methodology;Ultrasonic Extraction

2014-11-03

國家自然科學基金項目(81202903)；科技部中醫藥行業科研專項(201407003)；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養計劃項目(CIT&TCD201304179);國家藥典委員會科研課題(“中藥材品種限制產地和生長年限的研究和制定”)

蘇建春(1987-)，女，滿族，成都中醫藥大學碩士研究生，研究方向為中藥新劑型、新制劑、新技術研究以及中藥復方質量評價與物質基礎。

尹蓉莉(1952-)，女，成都中醫藥大學教授，研究方向為中藥新劑型、新制劑、新技術。E-mail：yinronglili@163.com 李化(1976-)，女，博士，中國中醫科學院副研究員，研究方向為中藥及其復方的質量評價與藥效物質基礎。E-mail：lihua621@hotmail.com

R284

A

1673-2197(2015)07-0032-04

10.11954/ytctyy.201507015