miR-193b體外協同增強多柔比星對乳腺癌細胞的抗腫瘤效應

應　曉，王再紅，王振華(衢州市中醫醫院檢驗科，浙江衢州324002)

miR-193b體外協同增強多柔比星對乳腺癌細胞的抗腫瘤效應

應曉△，王再紅，王振華
(衢州市中醫醫院檢驗科，浙江衢州324002)

［摘要］目的:研究微小RNA(microRNA，miR) -193b是否能增強多柔比星對乳腺癌細胞的殺傷效力及機制。方法:用real-time PCR方法檢測乳腺癌患者及健康對照者血漿中的miR-193b表達水平。MTT法檢測miR-193b聯合多柔比星對乳腺癌細胞系MDA-MB-231的殺傷效力。利用生物信息學、real-time PCR及Western blot方法驗證miR-193b是否調節乳腺癌細胞Mcl-1的表達。構建Mcl-1真核表達載體，MTT法檢測Mcl-1表達載體轉染對miR-193b聯合多柔比星治療乳腺癌療效的影響。結果:乳腺癌患者血漿中miR-193b表達水平顯著低于對照組。miR-193b聯合多柔比星治療組對MDA-MB-231細胞的殺傷效力顯著高于多柔比星單治療組。miR-193b轉染后，MDA-MB-231細胞Mcl-1的mRNA及蛋白表達水平均下降。miR-193b聯合多柔比星在Mcl-1表達載體轉染后對MDA-MB-231細胞的殺傷活性顯著低于未轉染Mcl-1表達載體的miR-193b聯合多柔比星組。結論: miR-193b通過靶向于Mcl-1增強多柔比星對乳腺癌細胞的殺傷效力。

［關鍵詞］微小RNA-193b; Mcl-1;乳腺癌; MDA-MB-231細胞;多柔比星

乳腺癌在女性中是世界上發病率最高的腫瘤。盡管如今腫瘤治療手段已經取得了很大的進展，乳腺癌的5年存活率卻仍然較低［1］。多柔比星是目前最主要的抗腫瘤藥物之一，能有效治療乳腺癌、子宮內膜癌、骨肉瘤等［2-4］。以多柔比星為主的化療方案在腫瘤治療中越來越被重視，然而目前亟待解決的問題就是如何選用最佳的輔助藥物以取得最好的療效并降低多柔比星的耐藥性［4］。MicroRNA是一種內源性非編碼單鏈RNA，能通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(3'-untranslated region，3'UTR)配對結合下調靶基因的表達。最近的研究發現microRNA的失調和腫瘤發生有關［5］。MicroRNA-193b (miR-193b)被報道與腫瘤的發生、轉移和耐藥產生有關［6-7］，然而miR-193b在乳腺癌中發揮何種生物作用目前仍不清楚，本研究的目的在于探討miR-193b是否在乳腺癌細胞中表達失調，并研究miR-193b是否能增強多柔比星對乳腺癌細胞的殺傷活性。

材料和方法

1患者資料

收集24例2012年1月～2015年1月乳腺癌患者的血漿，患者年齡34～68歲(平均年齡48.7歲)，另取23例經診斷未罹患乳腺癌的就診患者的血漿作為陰性對照，對照患者年齡31～68歲(平均年齡49.3歲)，均取得患者的知情同意。

2材料

多柔比星、噻唑藍［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于Sigma; DMEM培養基、胎牛血清購于Gibco;細胞蛋白提取液購于江蘇碧云天;兔抗人Mcl-1和兔抗人β-actin購于CST; miR-193b模擬物和陰性對照寡核苷酸(negative control oligonucleotide，NCO)購于上海吉瑪生物; miR-193b模擬物序列為5'-AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU-3'; NCO序列為5'-CUCGCCGUAACACUCCGGCUAA-3'。TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、pcDNA3.1和Lipofectamine 2000購于Invitrogen; SYBR Green試劑購于TaKaRa; PVDF膜購于Millipore; ECL試劑盒購于Pierce。各PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

3實驗方法

3.1細胞培養人乳腺癌細胞系MDA-MB-231購于ATCC。MDA-MB-231細胞系用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃恒溫培養箱中培養，通入5% CO2。

3.2Real-time PCR檢測miR-193b的表達血漿總RNA用TRIzol試劑提取。miR-193b的逆轉錄采用莖環real-time PCR法［8］。將U6作為內參照，miR-193b的相對表達由2－ΔΔCt法計算［9］。miR-193b逆轉錄引物序列為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCGGGAC-3'; U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

3.3Real-time PCR檢測Mcl-1的表達MDA-MB-231細胞總RNA用TRIzol試劑提取。cDNA用逆轉錄試劑盒按操作說明步驟由總RNA合成。Mcl-1的定量PCR擴增使用SYBR Green試劑，GAPDH作為內參照，Mcl-1的相對表達由2－ΔΔCt法計算。Mcl-1的上游引物為5'-TGGCTAAACACTTGAAGACC-3'，下游引物為5'-GGAAGAACTCCACAAACCC-3'; GAPDH的上游引物為5'-CCACTCCTCCACCTTTG-3'，下游引物為5'-CACCACCCTGTTGCTGT-3'。

3.4質粒構建將Mcl-1基因cDNA全長序列(Gene ID: NM_001197320)以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成pcDNA3.1-Mcl-1重組真核表達質粒［10］。

3.5瞬時轉染使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟將miR-193b (50 nmol/L)，pc-DNA3.1-Mcl(2 mg/L)轉染入MDA-MB-231細胞中，培養24 h。

3.6Western blot實驗收集細胞，用細胞蛋白提取液提取總蛋白質。將蛋白提取液用12.5% SDSPAGE進行分離，將電泳分離膠通過電轉方法將蛋白質轉到PVDF膜上，用Mcl-1或β-actin單克隆抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的Ⅱ抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。

3.7MTT法檢測藥物對腫瘤細胞的殺傷活性將MDA-MB-231細胞按5×103cells/well接種在96孔板上。將miR-193b轉染到細胞中，孵育24 h，然后再加不同濃度多柔比星培養48 h。加入20 mL MTT (5 g/L)培養4 h，移除孔內培養基，加入100 μL DMSO，振蕩后再570 nm波長下測定A值。細胞活力結果用實驗組與對照組的A值比值表示。

3.8細胞凋亡實驗將miR-193b轉染到MDA-MB-231細胞中，孵育24 h，然后再加2 μmol/L多柔比星培養48 h。之后將細胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI和Annexin V加入細胞中孵育20 min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡。

4統計學處理

實驗重復3次，實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示。用SPSS 13.0統計分析軟件進行統計分析，采用非配對雙側t檢驗或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1乳腺癌患者血漿miR-193b表達水平下降

人乳腺癌血漿的miR-193b表達量顯著低于對照患者血漿標本，提示miR-193b可能對乳腺癌發揮腫瘤抑制作用，見圖1。

Figure 1.The plasma level of miR-193b in human breast cancer patients or normal controls.Mean±SD.n=24.*P＜0.05 vs normal controls.圖1乳腺癌患者及對照組血漿miR-193b表達水平

2 miR-193b增強多柔比星對MDA-MB-231細胞的殺傷活性

miR-193b轉染后，MDA-MB-231細胞內miR-193b水平顯著升高(圖2)。miR-193b聯合多柔比星治療組對MDA-MB-231細胞的殺傷活性顯著高于同濃度多柔比星單治療組(圖3)。這提示miR-193b可顯著增強多柔比星對乳腺癌的治療效果。

Figure 2.Relative expression of miR-193b in MDA-MB-231 cells transfected with miR-193b mimic or NCO.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCO group.圖2 MDA-MB-231細胞用miR-193b或NCO轉染后的miR-193b相對表達水平

Figure 3.miR-193b significantly enhanced the cytotoxiciy of doxorubicin for MDA-MB-231 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs doxorubicin+ NCO group.圖3 miR-193b顯著增強多柔比星對MDA-MB-231細胞的殺傷活性

3 Mcl-1是miR-193b的直接靶點

生物信息學(http://www.targetscan.org/)結果表明Mcl-1可能是miR-193b的靶點(圖4)，進一步實驗結果表明miR-193b轉染MDA-MB-231細胞后Mcl-1的表達量無論在mRNA水平上還是蛋白水平上，都顯著低于未轉染miR-193b組，而多柔比星(2 μmol/L)對Mcl-1的表達無影響，見圖5。

Figure 4.TargetScan 6.2 software predicted that Mcl-1 is the putative target of miR-193b.圖4 TargetScan 6.2預測Mcl-1是miR-193b的靶基因

4 miR-193b通過Mcl-1/凋亡途徑增強多柔比星對MDA-MB-231細胞的殺傷活性

將miR-193b和pcDNA3.1-Mcl-1共轉染到MDA-MB-231細胞中檢測Mcl-1的表達，由于pcDNA3.1-Mcl-1質粒不存在3' UTR序列，因此pcDNA3.1-Mcl-1能對抗miR-193b對Mcl-1的下調作用(圖6)。MTT實驗結果則發現pcDNA3.1-Mcl-1的共轉染顯著抑制了miR-193b聯合多柔比星(2 μmol/L)對MDA-MB-231細胞的殺傷活性(圖7)，同時pcDNA3.1-Mcl-1的共轉染可顯著抑制miR-193b聯合多柔比星(2 μmol/L)對MDA-MB-231細胞的凋亡誘導效應(圖8)。這些結果提示miR-193b增強多柔比星對MDA-MB-231細胞的殺傷活性的機制可能是通過下調Mcl-1的表達水平。

Figure 5.Transfection of miR-193b significantly decreased the expression of Mcl-1 in MDA-MB-231 cells at mRNA and protein levels.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NCO group.圖5轉染miR-193b顯著降低MDA-MB-231細胞Mcl-1的mRNA和蛋白表達水平

Figure 6.pcDNA3.1-Mcl-1 abolished the down-regulation of Mcl-1 caused by miR-193b in MDA-MB-231 cells at mRNA and protein levels.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-193b+ pcDNA3.1-empty group.圖6 pcDNA3.1-Mcl-1拮抗miR-193b對MDA-MB-231細胞Mcl-1表達水平的下調

Figure 7.pcDNA3.1-Mcl-1 abolished the viability inhibition of MDA-MB-231 cells treated with miR-193b plus doxorubicin (2 μmol/L).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-193b+ doxorubicin group.圖7 pcDNA3.1-Mcl-1拮抗miR-193b聯合多柔比星對MDA-MB-231細胞活力的抑制作用

討論

在本研究中，作者發現相比于正常對照組，乳腺癌患者血漿中的miR-193b表達水平顯著下調，提示miR-193b可能起腫瘤抑制作用。有文獻報道表明miR-193b在其它各種腫瘤類型中也同樣發揮抗腫瘤作用，如miR-193b的低表達與胃癌細胞的增殖和轉移呈正相關［11］，而在胰腺癌細胞中轉染miR-193b則能顯著抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡［7］，這些報道和本研究的結果都提示miR-193b可能是一個抑癌基因。

Mcl-1是Bcl-2蛋白家族中一個重要的抗凋亡蛋白成員，它的高表達和腫瘤細胞的不良預后和多藥耐藥密切相關［12］。腫瘤細胞中Mcl-1的高表達會顯著增強腫瘤細胞的存活能力和對細胞毒性化療藥物的抵抗力，因此腫瘤的發生和發展都伴隨著Mcl-1表達的增加［13］。

多柔比星是目前腫瘤化療的一線藥物之一，盡管多柔比星的療效很好，但是隨著多柔比星的反復使用，腫瘤細胞會逐漸產生對多柔比星的耐藥性。為了提高多柔比星的療效，以多柔比星為主的聯合用藥方案被廣泛用于治療多種腫瘤，如多柔比星聯合紫杉醇或吉西他濱等都被證明能推遲腫瘤細胞對多柔比星的耐藥，提高化療效果［14-15］。然而將多柔比星和microRNA聯合用藥治療腫瘤目前的研究仍不充分。在本研究中，作者發現miR-193b可顯著提高多柔比星對乳腺癌細胞的殺傷效力，通過生物信息學，體外轉染miR-193b等方法進一步研究發現Mcl-1是miR-193b的靶點。構建Mcl-1表達載體并在MDA-MB-231細胞中強制表達Mcl-1后，miR-193b對多柔比星的協同抗腫瘤作用喪失，表明miR-193b增加乳腺癌細胞對多柔比星敏感性的分子機制可能是降低細胞內Mcl-1的表達。綜上所述，miR-193b/Mcl-1途徑與多柔比星的抗乳腺癌活性密切相關，它可能成為腫瘤化療的一個新的靶點。

Figure 8.pcDNA3.1-Mcl-1 abolished the apoptosis of MDA-MB-231 cells treated with miR-193b plus doxorubicin (2 μmol/L).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-193b+ doxorubicin group.圖8 pcDNA3.1-Mcl-1抑制miR-193b聯合多柔比星對MDA-MB-231細胞凋亡的誘導效應

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(責任編輯:陳妙玲，羅森)

miR-193b enhances cytotoxicity of doxorubicin by targeting Mcl-1 in breast cancer

YING Xiao，WANG Zai-hong，WANG Zhen-hua
(Clinical Laboratory，Quzhou Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine，Quzhou 324002，China.E-mail: qzyingxiao@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of microRNA (miR) -193b on doxorubicin therapy in breast cancer in vitro.METHODS: miR-193b level in plasma was detected by real-time PCR in the patients with breast cancer or the healthy controls.MTT assay was performed to measure the inhibitory effect of miR-193b plus doxorubicin on the growth of MDA-MB-231 cells.Bioinformatics，real-time PCR and Western blot were performed to determine whether the expression of Mcl-1 was regulated by miR-193b.Mcl-1 expression vector was constructed，and the role of Mcl-1 vector toward miR-193b plus doxorubicin-induced cytotoxicity in MDA-MB-231 cells was observed by MTT assay.RESULTS: Down-regulation of miR-193b was found in breast cancer patients.The miR-193b plus doxorubicin group showed a higher growth inhibition than cisplation group in MDA-MB-231 cells.The expression of Mcl-1 at both mRNA and protein levels was down-regulated after miR-193b transfection.The growth inhibition of MDA-MB-231 cells treated with miR-193b plus doxorubicin was significantly decreased after the transfection of Mcl-1 expression vector.CONCLUSION: miR-193b sensitizes doxorubicininduced cytotoxicity by targeting Mcl-1 in breast cancer.

［KEY WORDS］MicroRNA-193b; Mcl-1; Breast cancer; MDA-MB-231 cells; Doxorubicin

通訊作者△Tel: 0570-3086237; E-mail: qzyingxiao@163.com

［收稿日期］2015-04-23［修回日期］2015-05-15

［文章編號］1000-4718(2015)09-1584-05

［中圖分類號］R735.7

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.009