過表達腦紅蛋白抑制雙轉基因AD小鼠腦中Aβ誘導的凋亡*

楊　軍，戴頌陽，李　昱，張　雄(重慶醫科大學神經科學研究中心，病理教研室，重慶400016)

過表達腦紅蛋白抑制雙轉基因AD小鼠腦中Aβ誘導的凋亡*

楊軍，戴頌陽，李昱，張雄△
(重慶醫科大學神經科學研究中心，病理教研室，重慶400016)

［摘要］目的:研究AD雙轉基因(APPswe/PS1dE9)小鼠側腦室注射質粒pNGB后，過表達腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)對Aβ誘導的AD小鼠腦中細胞凋亡的影響及其潛在機制。方法:將24只鑒定后的13月齡AD雙轉基因陽性小鼠(雌雄各半)隨機分為對照組、側腦室注射生理鹽水+ pcDNA3.1(1 g/L)組和側腦室注射pcDNA3.1(1 g/L)+ pNGB組。采用免疫組化檢測鼠腦Aβ(1-42)表達情況，TUNEL染色檢測腦內細胞的凋亡情況; Western blot檢測鼠腦內與凋亡密切相關的cleaved caspase-3、caspase-9以及PI3K、p-Akt、Akt的蛋白水平。結果:與對照組和注射生理鹽水組比較，注射pNGB組小鼠腦內Aβ(1-42)的表達明顯受到抑制(P＜0.01)，TUNEL染色陽性細胞數也明顯減少(P＜0.01) ;過表達NGB能夠明顯抑制腦組織內cleaved caspase-3和caspase-9的蛋白表達(P＜0.01)，促進Akt磷酸化水平的增強(P＜0.01)。結論: pNGB過表達能夠明顯抑制Aβ的生成并抑制Aβ誘導的細胞凋亡，其機制可能與激活PI3K/Akt通路進而抑制與凋亡密切相關的cleaved caspase-3和caspase-9的表達有關。

［關鍵詞］腦紅蛋白; Caspases; PI3K/Akt通路;阿爾茨海默病

［修回日期］2015-08-05

腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是一類新型攜氧的球蛋白家族，其廣泛分布于人體，包括大腦皮質、海馬、丘腦、下丘腦和小腦以及一些內分泌器官。以往眾多的研究大多集中在NGB對腦缺血、缺氧的神經保護作用及其機制的探討，比如中風［1］。近來，新的研究已經證實NGB在阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)中也具有神經保護作用［2］，但其確切的分子機制尚不清楚。

眾所周知，AD是最為常見的神經進行性退行性變性疾病，其三大主要病理特征包括老年斑、神經纖維纏結和神經元丟失，而神經元的丟失主要表現為神經元細胞凋亡［3］。與凋亡密切相關的caspases家族是一類特異的凋亡信號轉導分子，它的激活是凋亡機制最關鍵的事件之一。Caspases家族成員眾多，其中caspase-9作為凋亡的啟動因子和caspase-3作為凋亡的執行者在凋亡的發生發展過程中發揮了重要作用。因此，如何抑制caspases相關的神經元凋亡可能成為預防和治療AD的關鍵策略［4］。

我們前期體外實驗已經證實了NGB可以通過抑制水溶性Aβ1-42處理的SH-SY5Y細胞內caspase-3 和caspase-9的表達進而抑制細胞的凋亡，從而發揮神經保護作用，但其確切的機制不清。有研究表明NGB是一個PI3K/Akt信號通路的誘導劑［5］，因此，本實驗以雙轉基因AD小鼠為研究對象，通過側腦室注射pNGB，觀察過表達NGB對腦內神經元的保護作用，并探討其機制，為NGB防治AD提供更加可靠的理論依據。

材料和方法

1實驗動物及鑒定

雙轉基因AD小鼠(HuAPP695swe/PS1-dE9)購自南京模式動物研究所，所有的小鼠均放在塑料籠子(每籠3～4只)，給予SPF級飼養室專用鼠糧和水飼養，濕度為(50±10) %、光照12 h明暗交替、溫度設置為23℃±1℃。

采用李國營等［6］報道的實驗方法并適當改進后對雙轉基因AD小鼠進行鑒定。將1月齡小鼠的鼠尾末梢剪下約0.5 cm，參照組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA進行PCR反應擴增APP和PS1基因。APP的上游引物為5’-GAC TGA CCA CTC GAC CAG GTT CTG-3’，下游引物為5’-CTT GTA AGT TGG ATT CTC ATA TCC G-3’，產物大小為350 bp; PS1的上游引物為5’-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3’，下游引物為5’-GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT-3’，產物大小為608 bp。反應總體系為25 μL: 2×Taq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8 μL，上游引物和下游引物各1 μL，基因組DNA 2.5 μL。反應條件: 94℃3 min; 94℃30 s，56 ℃1 min，72℃1 min，循環35次; 72℃5 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結果。

2動物分組、側腦室注射及取材

選取24只13月齡AD小鼠，雌雄各半，隨機分為3組:側腦室注射生理鹽水(NS)組、注射NS+ pcDNA3.1(1 g/L)組和注射pcDNA3.1(1 g/L)+ pNGB(20 μg)組。具體方法為用3.5%水合氯醛(350 mg/kg)對小鼠進行腹腔麻醉，然后用立體定位儀固定小鼠頭部，將一條聚乙烯管子植入側腦室(位置為前囟后0.2 mm，橫向1.3 mm，腹側2.5 mm)，然后固定在顱骨上。用微量注射器按實驗設計將不同物質注入側腦室，每周1次，連續8周。

將所有小鼠麻醉后固定于手術板上，迅速剪開皮膚和腹膜，暴露心臟和主動脈弓，灌注穿刺針從心尖刺入左心室并伸至主動脈根部，止血鉗固定后用灌注機將PBS從左心室灌入，同時剪開右心耳使血液流出，當右心耳流出無色液體，肝臟變白時，在冰上快速斷頭取腦，分為左右兩半，一半用多聚甲醛固定，用于形態學檢測;另一半置于EP管內，于－80℃保存，用于Western blot檢測。

3實驗方法

3.1免疫組織化學法取小鼠大腦切片，經脫蠟處理后，按照SP免疫組化試劑盒說明書進行染色:切片經PBS緩沖液沖洗后，置于檸檬酸鹽(0.01 mol/L)中微波修復20 min以暴露抗原，再放入3%的H2O2中15 min以滅活內源性過氧化物酶，經正常山羊血清封閉液封閉20 min后加入兔抗鼠Aβ1-42多克隆抗體(1∶100稀釋)，4℃過夜。第2天于37℃復溫1 h后加入生物素標記的羊抗兔IgG，37℃孵育30 min后加入HRP標記的鏈霉親和素，37℃孵育30 min，最后DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片，光學顯微鏡下觀察。

3.2TUNEL染色切片脫蠟、水化后，按照凋亡原位檢測試劑盒(凱基)說明書進行TUNEL染色: PBS 洗3遍，4%多聚甲醛固定并PBS洗2遍;用Proteinase K進行細胞通透30 min; PBS洗2遍后用平衡液進行平衡10 min;加TUNEL反應混合液于標本上，加蓋玻片37℃反應1 h;加入2×SSC液終止反應后PBS洗3遍后進行封閉;最后行DAB染色并用蘇木素復染，中性樹膠封片觀察。

3.3Western blot稱取10 mg腦組織，加入100 μL PRO-PREPTM蛋白提取液，－20℃放置20 min，13 000×g離心5 min，收集上清，Bradford法檢測蛋白濃度，經10% SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜，用含0.5 g/L脫脂奶粉的TBST液室溫封閉1 h; 用NGB(1∶250)、PI3K(1∶500)、p-Akt(1∶500)、Akt (1∶500)、cleaved caspase-3 (1∶500)、caspase-9 (1∶500)和β-actin(1∶5 000)抗體孵育，4℃冰箱孵育過夜后用TBST洗3次，加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育2 h，ECL法顯影后用凝膠化學成像系統分析其灰度值。

4統計學處理

所有數據均呈正態分布，以均數±標準差(mean±SD)表示。使用SPSS 15.0統計軟件對各組數據進行方差齊性檢驗，使用單因素方差分析比較組間的差異。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結果

1 APPswe/PSEN1dE9雙轉基因小鼠基因型鑒定

在長波紫外光下觀察瓊脂糖凝膠上的PCR條帶，在350 bp和608 bp處均出現條帶者即為APP/PS1陽性雙轉基因小鼠，見圖1。

Figure 1.Photograph of PCR products after agarose gel electrophoresis showed the genotype of double transgenic AD (APPswe/PSEN1dE9) mice for identification.圖1 APPswe/PSEN1dE9雙轉基因小鼠基因型鑒定圖

2側腦室注射后小鼠腦內NGB的表達情況

如圖2所示，用Western blot檢測轉基因小鼠經側腦室注射不同物質后腦內的NGB蛋白水平的表達情況。結果顯示轉基因小鼠側腦室注射生理鹽水和pcDNA3.1后，腦內NGB的表達水平沒有顯著差異;而側腦室注射pNGB后，腦內NGB的蛋白表達水平顯著增加(P＜0.01)。

3過表達NGB明顯降低AD小鼠腦內Aβ的產生

NS組，Aβ斑主要分布于腦皮質和海馬區，它們比較大、圓形、緊湊而且邊界清楚，一些斑塊的中心有淺的染色區，其Aβ斑塊在海馬區占約0.54%± 0.13%，在皮質區占約1.36%±0.16%;側腦室注射pcDNA3.1+ NS組，Aβ斑分別占約0.51%± 0.10%、1.34%±0.21%;而在注射pNGB組，其Aβ斑塊明顯減少，各自約占0.37%±0.09%、1.08%± 0.12%，明顯低于NS組(P＜0.01)，見圖3。

Figure 2.The expression of NGB in the brains of transgenic mice after intracerebroventricular injection.Mean±SD.n=4.*P＜0.01 vs NS group.圖2側腦室注射后轉基因小鼠腦內NGB的表達情況

4過表達NGB明顯降低AD小鼠腦內凋亡細胞

TUNEL染色結果顯示，側腦室注射NS組和pcDNA3.1+ NS組的海馬區及皮質區TUNEL染色陽性細胞數無統計學差異;而注射pNGB后，TUNEL染色陽性細胞明顯減少，與NS組和pcDNA3.1組比較差異顯著(P＜0.01)，見圖4。

5過表達NGB通過PI3K/Akt通路抑制cleaved caspase-3和caspase-9蛋白的表達

如圖5所示，與側腦室注射NS和pcNDA3.1+ NS兩組轉基因小鼠相比，注射pNGB+ pcDNA3.1的轉基因小鼠腦內的cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表達水平明顯受到抑制(P＜0.01) ;而PI3K和p-Akt的蛋白水平明顯增加(p＜0.01)，而總Akt水平卻沒有顯著改變。

Figure 3.Comparison of Aβ production and Aβ positive areas in the hippocampus and cortex of transgenic mice after intracerebroventricular injection.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs NS group.圖3側腦室注射后，轉基因小鼠海馬和皮質區Aβ斑生成情況及面積大小的比較

Figure 4.Comparison of TUNEL positive cells in the hippocampus and cortex of transgenic mice after intracerebroventricular injection (×200).Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs NS group.圖4側腦室注射后，轉基因小鼠海馬和皮質區TUNEL陽性細胞的比較

Figure 5.The protein levels of cleaved caspase-3，caspase-9，Akt，p-Akt and PI3K in the brains of transgenic mice after intracerebroventricular injection.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs pcDNA3.1+ pNGB group.圖5側腦室注射后，轉基因小鼠腦內cleaved caspase-3、caspase-9、Akt、p-Akt和PI3K蛋白的表達

討論

NGB是一類新型的攜氧球蛋白，廣泛存在于腦內，特別高表達于神經元，而在一些內分泌和視桿細胞也有少量表達。以前的研究已證明過表達NGB可以抵抗Aβ誘導的神經元的凋亡，從而發揮其神經保護作用［7］，但其具體的分子機制還未闡明。我們前期體外實驗通過水溶性Aβ1-42處理SH-SY5Y細胞建立了AD的細胞模型，轉染pNGB發現，過表達的NGB不僅能夠促進細胞的生長，而且還能夠保護細胞的膜電位，抑制細胞的凋亡，進一步研究其機制發現NGB可以抑制細胞內cleaved caspase-3和caspase-9的表達，從而發揮其神經保護作用，但確切的分子機制仍需要進一步證明［8］。因此，本課題的目的就是通過在體以雙轉基因AD小鼠為研究對象，側腦室注射pNGB，觀察過表達NGB對Aβ的產生以及Aβ誘導細胞凋亡的作用，并探討其潛在的分子機制損傷的作用，為NGB防治AD提供更加可靠的理論依據。

一般來說，NGB水平會隨著年齡的增加而降低。Sun等［9］從AD病人尸檢研究中發現，在AD早期NGB開始增加，進展期明顯增加，而到嚴重AD時，NGB的水平則降低到正常對照或以下，這說明NGB 在AD患者的腦內是一個動態變化的過程，早期至中期是增加的，而晚期則是明顯減少的。因此，本實驗以13月齡的AD小鼠為研究對象，通過Western blot實驗證實NGB的表達較低，側腦室注射pNGB后其表達水平明顯增多，因此可開展后續實驗。

過多的Aβ在腦皮質內沉積不僅可導致老年斑的形成，而且還能誘導神經元的凋亡，兩者都是AD發生發展的關鍵因素，因此，如何抑制Aβ的產生進而延遲或阻止神經元的凋亡可能將成為防治AD的重要策略。本研究分別通過免疫組化和TUNEL染色發現，相較于側腦室注射NS和pCDNA3.1組，側腦室注射pNGB后，過表達的NGB能夠明顯降低小鼠海馬和皮質內Aβ斑的產生以及細胞的凋亡。

自從2000年發現NGB以來，NGB潛在的作用靶點以及在中樞神經系統疾病中發揮神經保護作用的準確機制仍不清楚，存在著多種學說。許多學者認為NGB可以增加氧容量，因為NGB本身就是一類新型攜氧球蛋白，它具有與血紅蛋白、肌紅蛋白相似的功能。然而進一步的研究表明NGB能快速地自我氧化，與氧的結合率極低［10］。其次，NGB是一個NO清除劑［11］，可通過清除NO、氧自由基等有害物質，發揮其抗氧化的功能。第三，NGB具有抗凋亡作用，可抑制死亡信號轉導通路Rac-1介導的肌動蛋白組裝和聚集，也可抑制caspase的活性［12］。

Caspase的活性激活被認為是凋亡機制中最關鍵的一步。許多研究表明caspase的激活與AD的病理生成緊密相關。Li等［13］觀察到:過多的Aβ誘導星狀細胞和小腦顆粒細胞凋亡時，caspase-2、3、6水平增加; Francois等［14］證實APP有3個caspase剪切位點: (P4) DNVD 197 (P1 )/S、(P4 ) DYAD219 (P1)/G、(P4) VEVD720 (P1)/A; Raina等［15］也發現了caspase-3的激活導致β-APP的剪切，增加AD病人腦皮質和海馬神經元內的Aβ的產生和老年斑的形成。這些都表明激活caspase可以損害腦內APP的正常代謝，導致過多的Aβ產生和沉積。Aβ又促進caspase激活，剪切APP，進而形成一個惡性循環。因此，我們認為抑制caspase的活性可降低Aβ的產生，并抑制細胞凋亡。本實驗結果顯示，相較于側腦室注射NS和pCDNA3.1組，注射pNGB后，過表達NGB能夠明顯降低AD小鼠腦內cleaved caspase-3 和caspase-9的表達。

最近，有學者應用高濃度的PI3K抑制劑阻斷Akt的磷酸化，從而減少caspase-9蛋白的磷酸化，抑制其下游分子引起的一系列串聯反應而抑制凋亡進程，而促進神經干細胞的存活［16］。這表明活化PI3K/Akt對其下游靶基因的調節作用是促進細胞生存的一個重要途徑，為中樞神經退行性疾病的治療提供了一個潛在的作用靶點［17］。本研究發現，側腦室注射NGB后，過表達NGB能夠促進AD小鼠腦內PI3K、Akt磷酸化水平的增強，這說明NGB也有可能通過激活PI3K/Akt信號通路，進而抑制下游靶基因caspases的活性而抑制神經元的凋亡，從而保護神經元。

總之，NGB不僅降低了AD小鼠腦內Aβ的產生，也減輕Aβ誘導神經元的凋亡和細胞壞死。其潛在的機制可能是通過激活PI3K/Akt信號通路，進而抑制下游靶基因caspase的活性而發揮其神經保護作用，這將為NGB防治AD提供新的理論依據，也將為AD藥物治療提供新的靶點。

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(責任編輯:陳妙玲，羅森)

Overexpression of neuroglobin attenuates Aβ-induced apoptosis in brains of double transgenic AD mice

YANG Jun，DAI Song-yang，LI Yu，ZHANG Xiong
(Institute of Neuroscience＆Department of Pathology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.E-mail: zhangxiong_0@aliyun.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe the effects of neuroglobin (NGB) overexpression on the apoptosis induced by Aβ in the brains of double transgenic AD (APPswe/PS1dE9) mice and to explore its potential mechanisms.METHODS: Twenty-four 13-month-old double transgenic AD mice were randomly divided into 3 groups: intracerebroventricular injection with normal saline (NS) group，intracerebroventricular injection with pcDNA3.1 and NS group，and intracerebroventricular injection with pcDNA3.1 and pNGB group.Immunohistochemistry was used to detect the expression of Aβ(1-42)in the brains.TUNEL staining was used for analyzing the apoptosis，and the protein levels of cleaved caspase-3，caspase-9，PI3K，Akt and p-Akt were determined by Western blot.RESULTS: After intracerebroventricular injection with pNGB，the areas of Aβ(1-42)in the hippocampus and cortex were decreased compared with NS group and pcDNA3.1+ NS group (P＜0.01).The TUNEL-positive staining cells in the pNGB group were less than those in NS group and pcDNA3.1 group (P＜0.01).NGB overexpression attenuated the protein levels of cleaved caspase-3 and caspase-9 (P＜0.01)，but induced the production of PI3K and p-Akt (P＜0.01).CONCLUSION: Overexpression of pNGB significantly inhibits the generation of Aβ and attenuates the apoptosis induced by Aβ，indicating that NGB overexpression activates PI3K/Akt pathway and inhibits the production of cleaved caspase-3 and caspase-9，which were tightly related with apoptosis.

［KEY WORDS］Neuroglobin; Caspases; pI3K/Akt pathway; Alzheimer disease

通訊作者△Tel: 023-68485868; E-mail: zhangxiong_0@aliyun.com

*［基金項目］國家自然科學基金青年科學基金資助項目(No.81100948)

［收稿日期］2015-03-04

［文章編號］1000-4718(2015)09-1621-06

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.016