通過激活TRPV1達到快速有效治療性淺低溫方法的探討*

岳　靜，　陳　雯，　向桂芳，　李新華，　周碧云，　艾　玲，　陳明兵△(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院生殖醫學中心，麻醉學教研室，湖北武漢430030)

通過激活TRPV1達到快速有效治療性淺低溫方法的探討*

岳靜1，陳雯1，向桂芳1，李新華2，周碧云2，艾玲2，陳明兵2△
(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院1生殖醫學中心，2麻醉學教研室，湖北武漢430030)

［摘要］目的:通過二氫辣椒堿(DHC)調控瞬時受體電位陽離子通道香草酸亞型1(TRPV1)，探討達到治療性淺低溫的方法。方法: (1)觀察不同劑量DHC(2、3和4 mg/kg)皮下注射對小鼠體溫的影響，以20% DMSO溶于生理鹽水為對照組，尋求達到目標溫度(32～34℃)所需的最佳劑量; (2)清醒CD-1小鼠單次皮下注射最佳劑量DHC后，按1 mg· kg(－1)·h(-1)的速度持續輸注DHC，觀察是否有快速降溫及維持治療性淺低溫的最長時間; (3)相同劑量DHC皮下注射于成年(9～10周)和老年(24～27月)小鼠，觀察小鼠體溫變化。結果: (1)單次注射2 mg/kg DHC可在15 min內達到治療性淺低溫; (2)單次注射2 mg/kg DHC后，按1 mg·kg(－1)·h(－1)的速度持續輸注DHC可快速降溫，還可維持治療性淺低溫6 h; (3) DHC介導的低體溫在不同年齡模型中均適用。結論: DHC通過激活TRPV1通路可產生治療性低體溫，該方法可達到更強和更久的中心體溫降低，在不同年齡模型中均適用。

［關鍵詞］瞬時受體電位陽離子通道;治療性淺低溫;體溫調節

［修回日期］2015-05-07

在中國，中風是導致死亡和長期殘疾主要原因之一。鑒于80%以上缺血性中風是非致死性的，腦卒中發生后病人的治療及康復應當得以重視。現已證明，淺低溫(32～34℃)在心臟驟停及腦缺血等導致的腦損傷中可起到保護作用［1-3］。動物實驗也證實低體溫可產生中風后神經保護作用［4-5］。

傳統治療性低溫(therapeutic hypothermia，TH)是通過冷毛毯、酒精浴和體外降溫等方式緩慢降低中樞體溫。因耗時長，并發癥多，操作復雜，大大降低了其可行性和有效性［6-8］。

瞬時受體電位陽離子通道香草酸亞型1(transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1)是表達于熱敏神經纖維的熱敏受體，2005～2007年，有學者發現其參與了體溫調節［9-10］。二氫辣椒堿(dihydrocapsaicin，DHC)是TRPV1激動劑。已有研究發現，通過DHC藥理性激活TRPV1，中樞體溫過高的“假的”信息被傳遞到下丘腦，啟動機體的降溫機制，可以達到治療性淺體溫，發揮神經保護的作用［11-12］。

但如何將中樞體溫快速降低到治療范圍(32～34℃)且能夠長時間維持在有效的治療窗內，具體的誘導方法尚需研究;而且，年齡可能會影響TRPV1的作用［13］，這種誘導治療性低溫的方法是否適用于不同年齡組個體，尚缺乏實驗資料。因此，本研究旨在利用DHC激活TRPV1，探討達到治療性淺低溫的具體方法。與傳統降溫方式相比，尋求更加簡單易行且降溫迅速持久的降溫方法。

材料和方法

1材料

1.1動物CD-1小鼠，雌雄不限，9～10周齡(成年，26～30 g)或24～27月齡(老年，35～42 g)，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，許可證編號為SCXK2004-007。

1.2實驗器材帶數據記憶功能的電子溫度計(HH806W，Omega Engineering Inc.) ;熱電偶(40 G wire，Omega Engineering Inc.) ; PE-10導管(Instech Solomon Inc.) ;微量注射泵(Omega Engineering Inc.)。

1.3藥品DHC(Cayman)，以1 g/L的濃度溶于DMSO，注射前用生理鹽水稀釋5倍。

2實驗方法

所有手術過程中的小鼠通過異氟醚(5%誘導，2%維持)麻醉。術中，小鼠中樞體溫通過連接在身下的加溫墊維持在37℃左右。當小鼠不需要溫度支持，且中樞體溫保持在36℃以上時，轉移到溫暖的鼠籠中。注藥裝備及熱電偶的放置(圖1) :在小鼠后頸根部造一個小口，放入一根或兩根PE-10導管。導管埋置在皮下近尾部，終止于腹部以上區域。一根熱電偶以相同的方式置入并到達腹部側面區域。腹壁用20 G針穿孔，放入熱電偶以測量腹腔溫度(近似中樞體溫)。用縫線固定導管和電偶以防滑脫。熱電偶從頸部傳出的導管中穿過并固定于鼠籠上。PE-10導管連接于獨立的微量注射泵用于注射藥物。植入熱電偶和測量環境溫度的自由熱電偶連接于一個帶數據記憶功能的電子溫度計上，測量并記錄腹腔體溫。

Figure 1.The drug injection equipment and thermocouple.圖1注藥裝備及熱電偶的放置

給予清醒CD-1小鼠皮下單次注入不同劑量DHC (2、3和4 mg/kg)，對照組給與20% DMSO溶于生理鹽水，觀察其對體溫的影響;然后使用一個持續輸注裝置來找到一個可以維持在治療范圍的穩定中樞體溫DHC濃度。整個實驗過程中的環境溫度保持在24℃。

3統計學處理

數據采用均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間單獨比較使用t檢驗。組間重復測量資料使用重復測量ANOVA，多重比較使用Holm-Sidak檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1皮下給予不同劑量DHC對中樞體溫的影響

DC-1小鼠皮下注射DHC 2 mg/kg，中樞體溫可達到目標治療范圍;當劑量達3 mg/kg或4 mg/kg，中樞體溫低于目標體溫;且2 mg/kg的注射劑量可使中樞體溫維持在目標治療范圍達70 min，見圖2。

2單次注射2 mg/kg DHC后給予清醒小鼠1 mg ·kg－1·h－1的持續劑量對中樞體溫的影響

給予清醒DC-1小鼠單次注射DHC 2 mg/kg，然后按1 mg·kg－1·h－1的速度持續輸注，能夠快速達到目標溫度，持續注入DHC還可產生一個更穩定的樞體溫降低，6 h持續灌注后體溫迅速降低到34℃并維持在32～34℃。一旦輸注停止，中樞體溫則緩慢的上升到初始基礎值。從34℃上升到36℃所需時間為(45±2) min，上升速度為(0.045±0.002) ℃/min，顯著低于初始體溫降低速度，見圖3。

Figure 2.DHC decreased the core temperature of awaken mouse in a dose-dependent manner.Grey area means 32～34℃.n=4.圖2不同濃度DHC使清醒小鼠體溫呈濃度依賴性下降

Figure 3.After a bolus dose (2 mg/kg) of DHC was delivered at 0 min followed by continuous infusion (1 mg· kg－1· h－1) beginning at 30 min，the core temperature of the mice rapidly dropped to 34℃and then maintained the temperature within 32～34℃range (grey area) for the duration of 6 h (n=4).

圖3單次注射2 mg/kg DHC，然后持續給予1 mg·kg－1·h－1DHC，清醒小鼠能夠維持目標溫度6 h

3 DHC介導的低體溫在不同年齡模型中均適用

由于中風主要發病于老年群體，任何療法都應對老齡模型有效。給成年(9～10周)和老年(24～27月)小鼠均注射等劑量DHC (1.25 mg/kg)，發現老年組體溫的最大下降值比成年組大，低溫持續時間比成年組長，見圖4。

Figure 4.The effect of DHC on the mice at various ages.Mean ±SD.n=5.*P＜0.05 vs adult.圖4 DHC對不同年齡小鼠低溫持續時間的影響

討論

在中國，急性腦出血是導致死亡和長期殘疾主要原因之一。大量動物實驗和臨床研究證明，治療性淺體溫(32～34℃)在心臟驟停及腦出血等導致的腦損傷中起到保護作用，且越早使用治療性淺低溫對腦出血病人預后越好［1-3］。

治療性低溫是通過物理和藥物的降溫方式使人體中心體溫下降達到治療的目的，其中治療性淺體溫對治療腦損傷的效果最好。目前臨床上常用的是物理性降溫的方法，包括各種冰帽、冷毛毯、酒精浴等體外冷卻方法，一般需要2～3 h才能達到目標溫度。但當體溫達到目標溫度時，病人往往出現寒戰等副反應。為有效控制寒戰，必須通過聯合使用肌松藥或鎮靜麻醉劑來治療寒戰及長期寒戰引起的并發癥。但是肌松藥或鎮靜麻醉劑的使用卻會導致呼吸抑制，因此需要持續的機械通氣，這使得傳統的治療性淺體溫操作復雜，大大降低了它的實用性和有效性［6］。

在本研究中發現，皮下注射DHC在小劑量低溫誘導小鼠中耐受良好，主要表現為小鼠活動量減少。一項單獨的研究指出，相近劑量(0.75 mg ·kg－1· h－1)的皮下注射DHC在大鼠表現出同樣良好的耐受性。但有些作者發現1 mg·kg－1·h－1的注射量會產生輕微的心律加快，血壓升高，呼吸速率降低等副反應。這些副反應的發生率通常≤10%，且與任何外部壓力或不適跡象無關。需要注意的是，1 mg ·kg－1·h－1的用量略大于在此模型中產生淺低溫所需的劑量。若提高DHC用量(2.2～3 mg·kg－1·h－1)，會引起短暫的低血壓(＜2 min)、心動過緩和心電圖改變。引起心血管變化所需劑量比引起淺低溫所需的劑量至少要高3倍。很多研究顯示，盡早降溫可最大限度保護神經。然而，也有研究報道雖然降溫不及時，但延長降溫時間仍然可以保護神經。盡管較長時間的低溫期也有不良后果，但它可能與感染、心律失常和電解質紊亂等并發癥有關。我們認為相比之下患者神經腦保護更為重要。當然我們要盡量縮短從受傷到達到治療的目標溫度之間的時間，這對于這類患者尤為重要。

一些研究顯示，通過多次注射TRPV1激動劑能產生可持續性低溫。我們試圖調整此降溫的方法，使其更好地應用于臨床。第一步，本研究證明了達到治療溫度的時間可縮減3倍多至29 min。另外，淺低溫范圍可通過持續泵注穩定維持長達6 h。由此，這些方法都證明快速誘導和長時間維持治療性低溫的臨床可能性。此外，原則上，通過就地(患者家里、車禍現場或戰場上)開始這些降溫方法，達到治療目標溫度的時間還可能進一步縮短。而且復溫速度明顯低于降溫速度，也降低了快速復溫的一些并發癥，從而為大幅度提高這類患者生存率提供可能。

中風和心臟驟停患者病理上與高齡有明顯聯系，適合老齡人口的治療性低體溫療法顯得格外重要。主要現存的產生治療性低體溫的方法包括激活TRPV1通路。研究發現，TRPV1通道在高齡小鼠的背根神經節和外周神經表達減少。換言之，高齡小鼠相比成年鼠除了有更大量的隔熱脂肪以外還有更強的非寒戰產熱能力。讓人意外的是，當我們評估不同年齡小鼠DHC介導的低體溫時，發現老年組對DHC有更強的反應——低體溫時效明顯延長。對于此發現一種可能的解釋是，相比于成年小鼠，寒戰產熱能力的降低和新陳代謝的降低導致高齡鼠冷防御產熱缺陷，或年齡差異引起不同的藥物代謝率和清除率。此外，以上發現表明DHC介導的低體溫可以重復使用而不失效，并且在成年和老年模型中都有明顯作用［6-8］。

綜上所述，本研究發現通過激活TRPV1通路產生治療性低體溫的方法，并更進一步論證該方法可達到更強和更久的中心體溫降低。該方法無需聯合使用強鎮靜藥物和肌松藥以阻止冷防御反應，因此適合清醒有自主呼吸的不同年齡層患者。

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(責任編輯:林白霜，羅森)

Synergistic effect of TRPV1 activation on promoting mild therapeutic hypothermia

YUE Jing1，CHEN Wen1，XIANG Gui-fang1，LI Xin-hua2，ZHOU Bi-yun2，AI Ling2，CHEN Ming-bing2
(1Department of Reproductive Medical Center，2Department of Anesthesiology，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science＆Technology，Wuhan 430030，China.E-mail: chenmingbing808@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To look for a way of produ cing mild therapeutic hypothermia through regulating transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) pathway by dihydrocapsaicin (DHC).METHODS: Mice were subcutaneously injected with DHC at different doses (2 mg/kg，3 mg/kg and 4 mg/kg) in order to find the best dose for reaching the target temperature (32～34℃).20% DMSO dissolved in normal saline was used as control group.After a single subcutaneous injection of DHC at an optimal dose was given，awaken CD1 mice were continuously infused with DHC at dose of 1 mg· kg(－1)·h(－1)for providing a more rapid and stable temperature drop and duration of therapeutic mild hypothermia.The adult mice (9～10 weeks) and aged mice (24～27 months) were subcutaneously injected with DHC at the same dose，and the changes of the body temperature were monitored.RESULTS: DHC at 2 mg/kg resulted in a decrease in the core temperature within the target therapeutic range (32～34°C).After a bolus dose (2 mg/kg) was delivered at 0 min followed by continuous infusion (1 mg·kg(－1)·h(－1)) beginning at 30 min，a rapid drop of body temperature to 34℃was achieved and the body temperature was maintained within the ranges of 32 to 34℃for the duration of the 6 h continuous infusion.DHC-mediated hypothermia did not lose its effectiveness in the adult and aged models.CONCLUSION: DHC-induced activation of TRPV1 pathway produces mild therapeutic hypothermia.Besides，this method achieves stronger and longer center hypothermia and is suitable for the animals at different ages.

［KEY WORDS］Transient receptor potential cation channels; Mild therapeutic hypothermia; Thermoregulation

通訊作者△Tel: 027-83663423; E-mail: chenmingbing808@163.com

*［基金項目］湖北省自然科學基金資助項目(No.2013CFB130; No.2013CFB119; No.2013CFB140)

［收稿日期］2015-04-07

［文章編號］1000-4718(2015)09-1633-04

［中圖分類號］R363; R459.4

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.018