苯中毒病人TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1組蛋白化學修飾改變*

施益芬，甘一峰，沈志堅，俞　康(溫州醫科大學附屬第一醫院血液科，浙江溫州325015)

苯中毒病人TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1組蛋白化學修飾改變*

施益芬，甘一峰，沈志堅，俞康△
(溫州醫科大學附屬第一醫院血液科，浙江溫州325015)

［摘要］目的:研究拓撲異構酶Ⅱα(TOPOⅡα)啟動子調控因子SP1組蛋白化學修飾在苯中毒病人中的改變。方法: 25例臨床慢性苯中毒患者骨髓單個核細胞為病例組，25例正常人骨髓單個核細胞為對照組，染色質免疫沉淀技術探討TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1組蛋白乙酰化和甲基化水平的變化，RT-PCR法測定Sp1 mRNA的表達水平。結果:與對照組相比，臨床苯中毒病例TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1組蛋白H4和H3乙酰化水平下降(P＜0.01)，組蛋白H3K9甲基化水平升高(P＜0.01)，組蛋白H3K4甲基化水平無明顯改變。與正常對照組相比，臨床苯中毒病例TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1的mRNA表達水平降低(P＜0.05)。結論:慢性苯中毒TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1組蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修飾水平的改變伴隨著mRNA水平的變化。TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1可能通過組蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化修飾改變在苯中毒所致的造血毒性中發揮作用。

［關鍵詞］苯; SP1;組蛋白乙酰化;組蛋白甲基化;染色質免疫沉淀

［修回日期］2015-05-26

苯作為一種常用工業原料，可經多途徑進入人體，而骨髓細胞則為苯誘導產生毒性的靶器官之一，可造成多種骨髓造血功能障礙，引起血液系統嚴重而不可逆的損害，可致外周血血細胞減少甚至再生障礙性貧血、白血病。但迄今為止，苯導致造血系統毒性和白血病的分子機制尚未闡明清楚［1］。近年來，拓撲異構酶(topoisomerase，TOPO)在苯致造血毒性中的作用日益受到關注和確定［2-3］。本課題組前期的研究顯示，苯及其代謝物影響骨髓單個核細胞TOPOⅡα表達及活性，TOPOⅡα啟動子組蛋白乙酰化和甲基化水平改變是其含量下降的機制之一［3-5］。Sp1是TOPOⅡα啟動子重要的調控因子，使TOPO Ⅱα表達增加［6］。本研究進一步探討TOPOⅡα表達降低是否還伴隨著TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1組蛋白化學修飾水平的改變，為進一步認識苯中毒相關疾病的發病機制提供依據。

材料和方法

1對象

取本院血液內科臨床慢性苯中毒患者的骨髓標本25份，該組患者男性9例，女性16例;平均年齡32.5歲(20～56歲)，苯接觸時間≥6月(6個月～5 年)。工作環境中苯濃度平均87 mg/m3(50～1 000 mg/m3)，超過時間加權平均容許濃度(PC-TWA，6 mg/m3)及短時間接觸容許濃度(PC-STEL，10 mg/m3)。25例年齡、吸煙、飲酒習慣等匹配的健康志愿者骨髓標本作為對照，男性11例，女性14例;平均年齡33.8歲(19～58歲)。苯中毒患者診斷依據: GBZ 68-2002《職業性苯中毒診斷標準》診斷。本研究已通過溫州醫科大學附屬第一醫院倫理委員會的認證。所有骨髓捐獻者簽署知情同意書。

2主要試劑

淋巴細胞分離液(天津TBD生物技術發展中心) ;染色質免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)檢測試劑盒、抗乙酰化組蛋白H3抗體、抗乙酰化組蛋白H4抗體、抗二甲基組蛋白H3(K9)抗體和抗三甲基組蛋白H3(K4)抗體(Upstate) ; 37%甲醛(Sigma) ; TRIzol和PlatinumPCR Super-Mix (Invitrogen) ; GeneRulerTM50 bp DNA Ladder (Fermentas)。

3主要方法

3.1骨髓單核細胞懸液的制備取臨床苯中毒及健康志愿獻髓員的骨髓5 mL，肝素抗凝(5×104U/L)，淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離制備成單個核細胞懸液，調整細胞終濃度為1×109/L。臺盼蘭染色檢測活細胞率，要求拒染率達95%以上。

3.2ChIPChIP檢測用ChIP分析試劑盒，按產品說明書進行。簡言之，懸浮的骨髓單個核細胞用終濃度為1%的甲酰胺固定10 min，使轉錄因子與DNA交聯，用細胞裂解液破膜后，用超聲將DNA打碎成250～1 000 bp(此處提取的DNA片段命名為input DNA)。用特異性抗體［抗乙酰化組蛋白H3抗體、抗乙酰化組蛋白H4抗體和抗二甲基組蛋白H3 (K9)抗體、抗三甲基組蛋白H3(K4)抗體］沉淀DNA－蛋白復合物，用蛋白A瓊脂吸附復合物，經洗去非特異性吸附后，解交聯，沉淀的DNA片段－20℃保存備用(此DNA片段命名為ChIPed DNA)。ChIPed DNA通過PCR法對目標基因(TOPO Ⅱα啟動子調控因子Sp1)進行分析。

3.3PCR擴增ChIP后DNA產物針對Sp1的DNA序列設計的引物見表1。擴增條件為94℃5 min; 94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，35個循環; 72℃10 min，4℃30 min。反應完成后用1.8%瓊脂糖凝膠電泳并照相，Quantity One圖象分析系統分析實驗結果。Sp1水平變化=(IP苯中毒組/Input苯中毒組)/(IP對照組/Input對照組)。

3.4RT-PCR采用TRIzol法提取實驗組及對照組細胞總RNA;采用隨機引物法合成cDNA。針對Sp1 的mRNA序列設計引物(表1)。引物與GenBank基因序列核對無誤，采用β2微球蛋白作為內參照(表1)，進行PCR擴增，擴增條件為: 95℃10 min; 95℃30 s，62℃30 s，72℃30 s，35個循環; 72℃10 min。經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，Quantity One圖像分析系統分析實驗結果。以目標基因與β2微球蛋白擴增產物的吸光度值的比值計算表達水平。

表1　引物序列Table 1.The sequences of the primers

4統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，單因素方差分析及Turkey’s檢驗來確定組間差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1與乙酰化組蛋白H4結合的Sp1水平

病例組Sp1組蛋白H4乙酰化水平較對照組明顯下降(P＜0.01)，見圖1、表2。

Figure 1.The result of ChIP analysis for acetylated histone H4 binding Sp1 DNA level.M: marker; 1: input control; 2: IP AceH4 control; 3: input benzene; 4: IP AceH4 benzene.圖1乙酰化組蛋白H4結合的Sp1的ChIP分析

2與乙酰化組蛋白H3結合的Sp1水平

病例組Sp1組蛋白H3乙酰化水平較對照組下降(P＜0.01)，見圖2、表2。

Figure 2.The results of ChIP analysis for acetylated histone H3 binding Sp1 DNA level.M: marker; 1: input control; 2: IP AceH3 control; 3: input benzene; 4: IP AceH3 benzene.圖2乙酰化組蛋白H3結合的Sp1的ChIP分析

3與甲基化組蛋白H3K4結合的Sp1水平

病例組Sp1組蛋白H3K4甲基化水平較對照組稍下降，但差異無統計學意義，見圖3、表2。

Figure 3.The results of ChIP analysis for methylation histone H3K4 binding Sp1 DNA level.M: marker; 1: input control; 2: input benzene; 3: IP MethH3K4 control; 4: IP MethH3K4 benzene.圖3甲基化組蛋白H3K4結合的Sp1的ChIP分析

4與甲基化組蛋白H3K9結合的Sp1水平

病例組Sp1組蛋白H3K9甲基化水平較對照組升高(P＜0.01)，見圖4、表2。

Figure 4.The results of ChIP analysis for methylation histone H3K9 binding Sp1 DNA level.M: marker; 1: input control; 2: IP MethH3K9 control; 3: input benzene; 4: IP MethH3K9 benzene.圖4甲基化組蛋白H3K9結合的Sp1的ChIP分析

5 RT-PCR結果

Sp1的mRNA水平較對照組降低(P＜0.05)，見圖5。

討論

苯所致造血毒性已得到廣泛重視，但其毒性機制仍遠未闡明。普遍認為苯造血毒性是氧化損傷、拓撲異構酶功能失調、DNA損傷、免疫異常等多因素多水平綜合作用的結果［7-8］，推測苯誘發造血毒性涉及關鍵靶基因的細胞遺傳學改變(通過誘導造血干細胞基因突變，染色質或表觀遺傳學、基因組不穩定通路)，最終導致白血病干細胞形成及克隆演變［1］。表觀遺傳機制的改變導致的基因失活是近年來科學研究的熱點，主要包括組蛋白乙酰化、組蛋白甲基化、DNA甲基化和染色質高級結構中其它成分的修飾，這些修飾改變染色質構型，導致基因轉錄調節發生變化，進而導致細胞增殖失常。組蛋白乙酰化與基因轉錄激活有關，去乙酰化常見基因轉錄沉默［9］，組蛋白H3K4甲基化與基因轉錄活化相關［10］，而組蛋白H3K9甲基化常見基因轉錄沉默［11］。我們的前期研究發現苯所致造血毒性與TOPOⅡα的表達下降相關，而TOPOⅡα啟動子組蛋白乙酰化、甲基化化學修飾改變是其表達下降的機制之一［3-5］。

有學者認為TOPOⅡ的mRNA水平降低與其穩定性無關，而是由于其上游的轉錄因子表達水平降低，導致拓撲異構酶Ⅱ的啟動子區活性下降，轉錄減少所致［12］。我們前期的研究提示TOPOⅡα表達降低與TOPOⅡα啟動子組蛋白乙酰化、甲基化水平改變有關，是否TOPOⅡα表達降低還伴隨著TOPOⅡα啟動子調控因子組蛋白乙酰化、甲基化水平的改變?HeLa cell［J］.Int J Mol Sci，2009，10(7) : 3255-3268.

表2　Sp1組蛋白乙酰化和甲基化化學修飾水平的變化Table 2.Histone acetylated and methylation modification change of Sp1 (Mean±SD.n=5)

Figure 5.The results of RT-PCR for determining Sp1 mRNA expression level.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control.圖5 TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1 mRNA水平的變化

已知的TOPOⅡα啟動子調控因子包括Sp1、ATF-2、Sp3、NF-YA、c-MYB、P53、ICBP90和c-Jun。Sp1是TOPOⅡα啟動子重要的調控因子。人類TOPOⅡα啟動子功能區有5個CCAAT盒及2個GC盒。2個GC盒GC1和GC2位于TOPOⅡα啟動子的最近及最遠區域，Sp1通過其3個“鋅指結構”與TOPOⅡα啟動區的GC/GT盒結合，招募啟動子區的RNA聚合酶，增強TOPOⅡmRNA的轉錄，上調TOPOⅡ的表達［6，13-14］。我們針對TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1設計了相應的適合ChIP后產物的引物，來觀察臨床病例研究中Sp1水平的改變。我們的實驗結果發現:臨床苯中毒患者TOPOⅡα啟動子調控因子Sp1結合的組蛋白H4和H3乙酰化水平降低，組蛋白H3K9甲基化水平升高，組蛋白H3K4甲基化水平無明顯改變。結合組蛋白乙酰化與基因轉錄激活有關，去乙酰化常見基因轉錄沉默，組蛋白H3K4甲基化與基因轉錄活化相關，而組蛋白H3K9甲基化常見基因轉錄沉默，Sp1組蛋白H4、H3乙酰化及H3K9甲基化水平的改變可能參與了TOPOⅡα表達的降低，DNA水平證實了苯中毒患者骨髓單個核細胞中TOPOⅡα啟動子的調控因子水平Sp1的改變，且伴隨著Sp1的mRNA表達水平降低，與TOPOⅡα啟動子的調控因子DNA水平的變化平行，為Sp1組蛋白乙酰化、甲基化水平改變參與TOPOⅡα表達降低提供了一定的依據。

本課題組將進一步研究組蛋白去乙酰化酶抑制劑和組蛋白去甲基化酶對造血損傷的逆轉及對TOPOⅡα啟動子、啟動子調控因子Sp1組蛋白化學修飾的改變，為更進一步認識苯中毒相關疾病的發病機制及相關疾病的診療提供一定的依據。

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(責任編輯:盧萍，羅森)

Histone acetylation and methylation modification of topoisomeraseⅡα promoter regulatory factor Sp1 in patients with chronic benzene poisoning

SHI Yi-fen，GAN Yi-feng，SHEN Zhi-jian，YU Kang
(Department of Hematology，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325015，China.E-mail: kangyu62@hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the histone modification changes of topoisomeraseⅡα(TOPOⅡα) promoter regulatory factor Sp1 in the patients with chronic benzene poisoning.METHODS: The bone marrow samples were collected from 25 chronic benzene poisoning cases and 25 controls.The chromatin immunoprecipitation assay was carried out to study the possible mechanism of TOPOⅡα promoter regulatory factor Sp1 expression changes.The mRNA expression of Sp1 was detected by RT-PCR.RESULTS: Compared with the controls，the histone H4 acetylation and histone H3 acetylation of Sp1 in the chronic benzene poisoning patients significantly decreased (P＜0.01)，and histone H3K9 methylation level of Sp1 increased (P＜0.01)，but the histone H3K4 methylation level of SP1 was not obviously changed (P＞0.05).The mRNA expression of Sp1 in the chronic benzene poisoning patients was significantly lower than that in the controls (P＜0.05).CONCLUSION: In chronic benzene poisoning patients，the histone acetylation and methylation modification changes of TOPOⅡα promoter regulatory factor Sp1 accompanied with the changes of mRNA level are observed.Histone H4 and H3 acetylation and H3K9 methylation modification of Sp1 may play an important role in the benzene’s hematopoietic toxicities.

［KEY WORDS］Benzene; Sp1; Histone acetylation; Histone methylation; Chromatin immunoprecipitation

通訊作者△Tel: 0577-55578489; E-mail: kangyu62@hotmail.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.81172613) ;溫州市科技局科研基金資助項目(No.Y20120004; No.Y20090238)

［收稿日期］2015-04-24

［文章編號］1000-4718(2015)09-1662-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.024