Egr-1基因轉染對糖尿病小鼠腎臟炎癥反應的影響*

劉　潔，　張海松，馬永軍，劉　莉，侯明輝，王紅杰，楊　惠(河北大學附屬醫院內分泌科，腎內科，科研處，河北保定07000;滿城縣醫院腫瘤內分泌科，河北滿城070;保定市第一醫院兒科，河北保定07000)

Egr-1基因轉染對糖尿病小鼠腎臟炎癥反應的影響*

劉潔1，張海松2△，馬永軍4，劉莉5，侯明輝1，王紅杰3，楊惠4
(河北大學附屬醫院1內分泌科，2腎內科，3科研處，河北保定071000;4滿城縣醫院腫瘤內分泌科，河北滿城072150;5保定市第一醫院兒科，河北保定071000)

［摘要］目的:觀察Egr-1基因轉染對糖尿病小鼠腎組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)及細胞間黏附分子1 (ICAM-1)表達的影響，探討Egr-1在糖尿病腎病發病機制中的作用。方法:制備糖尿病小鼠模型，成模后隨機選取10只作為糖尿病組，剩余40只每周1次經尾靜脈分別注射空質粒、Egr-1表達質粒和Egr-1 siRNA質粒，并設立正常對照組。實驗共4周，于第4周末收集各組小鼠腎組織標本，分別應用western blot和免疫組織化學染色測定腎組織中Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達;應用電鏡觀察腎小球超微結構的改變。結果:糖尿病小鼠腎組織Egr-1、TNF-α及ICAM-1表達增強，基底膜普遍增厚，系膜區基質增多，上皮細胞足突融合; Egr-1基因轉染后上述變化趨勢更加顯著。siRNA質粒轉染組上述變化較糖尿病組明顯減輕。結論: Egr-1可上調TNF-α及ICAM-1表達，促進系膜細胞增殖及系膜外基質積聚，可能是加速腎小球硬化的可能機制之一。

［關鍵詞］早期生長反應蛋白1;基因轉染;糖尿病腎病;腫瘤壞死因子α;細胞間黏附分子1

早期生長反應蛋白1(early growth response protein 1，Egr-1)為即刻早期蛋白家族中最重要的一員，在神經、循環、泌尿、呼吸等多個系統控制細胞增殖、分化和凋亡［1］。越來越多的研究認為轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、細胞間黏附分子1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)等炎癥因子在糖尿病腎病發生發展中起重要的作用，Egr-1可通過與這些基因啟動子上的Egr-1結合位點作用直接參與其表達調控［2］。由此推測，Egr-1激活可能在糖尿病腎病發生過程中起重要作用。

本實驗以糖尿病CD-1小鼠為研究對象，應用基因轉染技術，將目的基因Egr-1轉染至動物腎臟組織，使其在靶器官內高效表達，觀察Egr-1對小鼠腎組織中TNF-α和ICAM-1表達的影響，探討Egr-1在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)發生、發展中的作用機制。

材料和方法

1材料

健康雄性清潔級CD-1小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)，二級動物合格證號為0143406，該品系自1999年由美國Charles River Lab引入，pcDNA3.1-Egr-1、pcDNA3.1由Invitrogen提供。TransIT-EE轉染系統(Mirus Bio)鏈脲佐菌素(Sigma) ;兔抗小鼠Egr-1單克隆抗體(Santa Cruz) ;兔抗小鼠TNF-α和ICAM-1多克隆抗體(北京博奧森生物公司)。

2方法

2.1動物實驗選擇CD-1小鼠共50只，經單側腎切除后，隨機選取10只作為正常對照組，其余40只一次性腹膜腔注射STZ(150 mg/kg)，制備糖尿病模型，成模后隨機選取10只作為糖尿病組，剩余30只經尾靜脈分別注射空質粒、Egr-1質粒和Egr-1 siRNA質粒，實驗期間動物自由進食、飲水，不使用胰島素及其它降糖藥物。每周1次小鼠尾靜脈注射，正常對照(normal control，NC)組和糖尿病模型(diabetic)組: 2 mL單純轉染系統溶液(TransIT-EE Hydrodynamic Delivery Solution) ;空質粒(pcDNA 3.1)組: 30 μg空質粒+2 mL轉染系統溶液; Egr-1表達質粒(pc DNA3.1-Egr-1)組: 30 μg Egr-1質粒+ 2 mL轉染系統溶液; Egr-1 siRNA組: 30 μg Egr-1 siRNA質粒+2 mL轉染系統溶液，共4周。在注射前30 min將質粒和載體混勻，將小鼠放于合適體積的離心管中固定好，用乙醇消毒尾部，使尾靜脈充分充盈，經由尾靜脈快速注射。于尾靜脈注射4周末每組取10只小鼠，用代謝籠收集24 h尿，用于測定尿蛋白(urine protein，UP)，記錄體重(body weight，BW) ; 1%戊巴比妥鈉(5 mL/kg體重)腹膜腔注射麻醉成功后股動脈取血，分離血清，用于測定血糖(blood glucose，BG)和血肌酐(serum creatinine，SCr) ;切取右腎，濾紙吸干血跡后稱重，置于冰臺上，除掉被膜，取部分腎皮質切成1 mm×1 mm×1 mm大小體積，置于4%戊二醛，用于透射電鏡觀察，取部分腎組織置于4%多聚甲醛(0.01 mol/L PBS配制)，體積比大于1/10，固定48 h，用于免疫組化檢測，其余腎皮質組織迅速置于液氮中按Western blot要求制備蛋白裂解液，－80℃保存。

2.2血、尿生化指標測定每個樣本取20 μL血清和20 μL尿液用AU 2700型自動生化分析儀測定BG、SCr和UP。

2.3透射電鏡觀察腎皮質電鏡標本采用戊二醛、鋨酸雙重固定，乙醇、丙酮梯度脫水，Epon812環氧樹脂包埋，LKB-V超薄切片，鈾-鉛雙重染色，JOEL-1200EX透射電鏡觀察濾過膜及系膜病變情況并攝片。

2.4免疫組織化學檢測各組小鼠腎組織中Egr-1、TNF-α和ICAM-1蛋白表達石蠟切片常規脫蠟至水，3%雙氧水室溫避光孵育10 min;蒸餾水沖洗2次，各5 min;抗原修洗2次，各5 min;取出抗原修復盒，室溫自然冷卻，約45 min; 0.01 mol/L PBS沖洗2次，每次5 min，滴加I抗，4℃過夜; 0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min，滴加II抗復合體，37℃孵育30 min; 0.01mol/L PBS沖洗3次，每次5 min; DAB顯色;蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片，光鏡觀察，陽性部位呈棕黃色。免疫組化結果應用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統采集圖像，并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析。每張切片腎皮質范圍內隨機選取10個腎小球(×400)，計算單位面積陽性染色區域平均積分吸光度(IA)，以各組的均值進行比較。

2.5Western blot法檢測各組小鼠腎組織中Egr-1、TNF-α和ICAM-1蛋白表達每個樣品取50 μg總蛋白，加6×SDS加樣緩沖液，在沸水中變性4 min，經10% SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至PVDF膜; 5%脫脂奶粉37℃封閉PVDF膜1.5h，I抗(Egr-1和TNF-α I抗工作液濃度為1∶200，ICAM-1 I抗工作液濃度為1∶300，GAPDH I抗工作液濃度為1∶500)，4℃過夜。TTBS洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或小鼠II抗(1∶18 000稀釋)，37℃孵育2 h; TTBS洗膜，滴加ECL試劑，將PVDF膜放入X光片暗盒，在暗室中壓片，顯影，定影。用UVP的Lab-Works 4.5軟件對Western條帶進行定量分析，讀取積分吸光度值(IA)。

3統計學處理

實驗數據用均數±標準差(mean±SD)表示，方差齊性檢驗用Levene法，計量資料多樣本均數間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，所有統計學分析均采用SPSS 17.0統計軟件處理。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1轉染Egr-1基因后小鼠腎重/體重、BG和腎功能的改變

第4周末，糖尿病組較NC組小鼠腎重/體重增加，BG和SCr水平明顯升高，24 h尿蛋白定量明顯增加(P＜0.05)，空質粒組和糖尿病組相比差異無統計學意義，但pcDNA3.1-Egr-1組變化趨勢更明顯，與糖尿病組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，Egr-1 siRNA組小鼠腎重/體重、BG、SCr及24 h UP較糖尿病組有所下降，但仍高于NC組，見表1。

表1　各組小鼠BG、腎重/體重、肌酐及尿蛋白的改變Table 1.Results of BG，KW/BW，SCr and UP in different groups (Mean±SD.n=10)

2轉染Egr-1基因對小鼠腎組織超微結構改變的影響

透射電鏡結果顯示:正常對照組可見基膜厚度正常，足細胞體積較大，核著色較淺，胞質內有豐富的粗面內質網和線粒體。胞體分出大的初級突起和指狀的次級突起形成足突，緊貼于毛細血管基膜外，突起之間可見裂孔。系膜區無擴張。糖尿病組和空質粒組可見足細胞胞突多呈連續性附著于基膜上，形成足突融合，腎小球基膜明顯增厚，內皮細胞排列紊亂，正常屏障結構喪失。Egr-1表達質粒組上述腎組織的超微結構改變更加顯著; Egr-1 siRNA組上述腎組織的超微結構則明顯改善，見圖1。

Figure 1.Glomerular ultrastructure under transmission electron microscope in the five groups (×20 000).圖1轉染Egr-1基因后各組小鼠腎組織超微結構的改變

3免疫組織化學檢測各組小鼠Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達

免疫組化染色顯示，Egr-1主要表達于腎小球系膜區、內皮細胞及臟層上皮細胞、近端和遠端腎小管上皮細胞，以胞核著色為主，胞漿偶有著色。TNF-α 和ICAM-1主要表達于系膜細胞、內皮細胞及腎小管上皮細胞，均以胞漿著色為主。與NC組相比，糖尿病組和空質粒組Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達均明顯升高(P＜0.01) ; Egr-1表達質粒組4個指標表達均明顯增強(P＜0.05) ; Egr-1 siRNA組4個指標表達均明顯下降，但仍高于NC組(P＜0.05)，見圖2。

4 Western blot檢測各組小鼠Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達

Western blot結果顯示，與正常對照組相比，糖尿病組和空質粒組Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達均明顯升高(P＜0.01) ;兩組之間上述指標的變化無明顯差異; Egr-1表達質粒組3個指標表達均明顯增強(P＜0.05) ; Egr-1 siRNA組3個指標表達均明顯下降，但仍高于NC組(P＜0.05)，見圖3。

討論

越來越多的研究證明炎癥在DN的病理過程中起重要作用［3-4］。糖尿病狀態下腎小球往往處于炎癥和氧化應激狀態，伴有炎癥因子、急性期反應產物及其它應激分子水平升高，從而激活應激激活信號通路如MAPK/ERK等信號通路，進一步活化Egr-1、NF-κB等核轉錄因子，上調眾多的與炎癥反應相關的下游靶基因表達，形成瀑布效應，加速腎小球硬化。

Egr-1是即刻早期蛋白家族中重要的一員［5-6］，是細胞增殖、分化、凋亡的重要的上游介質［7］。Egr-1在動物及人體內廣泛分布，多種信號刺激可誘導其迅速表達，通過調控其下游的一些決定細胞核型變化的長期反應基因的表達，參與體內眾多的病理生理過程。Egr-1參與細胞的生長和分化，細胞凋亡，炎癥和腫瘤［8-9］，還在神經軸突的生長、促進創傷的修復，維持女性正常的生殖能力等方面發揮著一定作用［10-11］。應激、缺血缺氧、細菌內毒素、細胞因子、離子射線、腫瘤等均可引起細胞膜去極化，激活處于休眠狀態的Egr-1，使細胞由G0期進入G1期，導致細胞增殖［12］。研究還發現，Egr-1還能直接調節與細胞外基質代謝有關的基因表達，如MT1-MMP、PAI、FN等［2］，表明Egr-1與細胞外基質代謝密切相關。我們在本實驗中構建半腎切除糖尿病CD-1小鼠模型，應用免疫組織化學和Western blot檢測Egr-1在小鼠腎臟中的蛋白表達，結果顯示糖尿病組小鼠腎小球中Egr-1表達明顯增強，電鏡下觀察腎小球出現了明顯病理改變，具體表現為基底膜不規則增厚，部分呈駝峰樣隆起，臟層上皮細胞足突融合，血管內皮細胞窗孔消失，糖尿病小鼠血肌酐和24小時尿蛋白均明顯升高，且隨病程逐漸加重，轉染Egr-1基因后上述變化進一步增強，而轉染Egr-1干擾質粒后上述變化減弱，進一步證明Egr-1表達增強與腎小球系膜細胞增生、細胞外基質聚集及腎功能下降有關。

Figure 2.Immunohistochemical staining for Egr-1，TNF-α and ICAM-1 in the renal tissue of all groups(×400).Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs NC;#P＜0.05 vs diabetic.圖2各組小鼠腎組織中Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達

晚近研究表明Egr-1可誘導擴大炎癥反應。Egr-1不僅可促進細胞從靜止期進入增殖期，調節細胞增殖和分化，而且還可通過細胞因子如ICAM-1、血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、IL-1β、TNF-α等誘導多種炎癥蛋白的表達，啟動炎癥的發生［13-14］。炎癥因子包括巨噬細胞炎癥蛋白2 (macrophage inflammatory protein 2，MIP 2)、MCP-1、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、干擾素誘生蛋白(interferon-inducible protein，IP) -10以及受激活調節正常T細胞表達和分泌因子(RANTES)［15］。Egr-1還可能誘導某些細胞因子受體，如趨化因子受體(chemokine receptor，CCR)和CXCR的表達而加重炎癥過程。有些研究通過調節Egr-1的表達減輕炎癥反應，已有確切證據證實TNF-α基因啟動子內含有Egr-1結合位點，Egr-1通過與此位點與TNF-α結合而調控其的表達。Silverman等［16］通過基因敲除技術已證明在肺部炎癥時，Egr-1的活化與TNF-α的表達直接相關。本實驗免疫組化和Western blot檢測結果顯示，Egr-1質粒轉染組小鼠Egr-1表達較糖尿病組明顯增強，TNF-α和ICAM-1的表達也均強于糖尿病組，而Egr-1 siRNA轉染組Egr-1表達明顯受抑制，TNF-α和ICAM-1的表達與糖尿病組相比也均明顯下降，證明Egr-1通過調節TNF-α、ICAM-1等因子的表達，使腎臟細胞增殖及組織局部單核/巨噬細胞浸潤增加，分泌細胞因子、炎癥介質、活性氧自由基、一氧化氮和金屬蛋白酶等加速腎小球硬化，進而在DN炎癥損害和纖維化中起到了重要作用，但其具體作用機制尚需進一步研究證實。

Figure 3.The protein expression of Egr-1，TNF-α and ICAM-1 in the renal tissue of all groups detected by Western blot.＊＊P＜0.01 vs NC;#P＜0.05 vs diabetic.圖3各組小鼠腎組織Egr-1、TNF-α和ICAM-1的表達

總之，目前對Egr-1具體的生物學功能尚不清楚，探討Egr-1高表達對腎小球系膜細胞TNF-α、ICAM-1的表達及系膜細胞增殖，細胞外基質沉積的影響，對進一步明確Egr-1在糖尿病腎病發生、發展中的作用機制具有重要意義，將為臨床提供糖尿病腎病早期干預的新靶點，為人類防治糖尿病腎病提供理論依據。

［參考文獻］

［1］Hofer G，Grimmer C，Sukhatme VP，et al.Transcription factor Egr-1 regulates glomerular mesangial cell proliferation［J］.J Biol Chem，1996，271(45) : 28306-28310.

［2］曾慶富，牛海艷.肺纖維化機制的研究進展［J］.中華病理學雜志，2001，30(5) : 371-373.

［3］王嵐，李英，程萬里，等.氯沙坦對糖尿病大鼠腎小管間質p38MAPK和TGF-β1表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2008，24(4) : 607-609.

［4］段惠軍，李英，張濤，等.高糖對大鼠腎小球系膜細胞ERK轉導通路的影響［J］.中國病理生理雜志，2007，23(2) : 416.

［5］Blaschke F，Bruemmer D，Law RE.Egr-1 is a major vascular pathogenic transcription factor in atherosclerosis and restenosis［J］.Rev Endocr Metab Disord，2004，5(3) : 249-254.

［6］Khachigian LM.Early growth response-1 in cardiovascular pathobiology［J］.Circ Res，2006，98(2) : 186-191.

［7］馬躍峰，付維利，譚文翔，等.大鼠小體積肝移植物再灌注早期Egr-1的表達及其意義［J］.中國普通外科雜志，2010，19(1) : 13-17.

［8］Egerod FL，Bartels A，Fristrup N，et al.High frequency of tumor cells with nuclear Egr-1 protein expression in human bladder cancer is associated with disease progression［J］.BMC Cancer，2009，9: 385.

［9］Kyung Hee Lee，Jae-Ryong Kim.Hepatocyte growth factor induced up-regulations of VEGF through Egr-1 in hepatocellular carcinoma cells［J］.Clin Exp Metastasis，2009，26 (7) : 685-692.

［10］Parra E，Ortega A，Saenz L.Down-regulation of Egr-1 by siRNA inhibits growth of human prostate carcinoma cell line PC-3［J］.Oncol Rep，2009，22(6) : 1513-1518.

［11］Shin SY，Kim JH，Baker A，et al.Transcription factor Egr-1 is essential for maximal matrix metalloproteinase-9 transcription by tumor necrosis factor α［J］.Mol Cancer Res，2010，8(4) : 507-519.

［12］梁曉歡，邱娜旋，楊增明.哺乳動物生殖過程中早期生長反應因子1的調節及功能［J］.細胞生物學雜志，2009，31(4) : 509-513.

［13］Yan SF，Fujita T，Lu J，et al.Egr-1，a master switch coordinating upregulation of divergent gene families underlying ischemic stress［J］.Nat Med，2000，6(8) : 1355-1361.

［14］Shi L，Kishore R，McMullen MR，et al.Lipopolysaccharide stimulation of ERK1/2 increases TNF-alpha production via Egr-l［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2002，282(6 Pt 1) : C1205-C1211.

［15］Chen Y，Lui VC，Rooijen NV，et al.Depletion of intestinal resident macrophages prevents ischaemia reperfusion injury in gut［J］.Gut，2004，53(12) : 1772-1780.

［16］Silverman ES，De Sanctis GT，Boyce J，et al.The transcription factor early growth-response factor 1 modulates tumor necrosis factor-α，immunoglobulin E，and airway responsiveness in mice［J］.Am J Respir Crit Care Med，2001，163(3 Pt 1) : 778-785.

(責任編輯:陳妙玲，羅森)

·短篇論著·

Effect of Egr-1 gene transfection on renal inflammation in diabetic mice

LIU Jie1，ZHANG Hai-song2，MA Yong-jun4，LIU Li5，HOU Ming-hui1，WANG Hongjie3，YANG Hui4
(1Department of Endocrinology，2Department of Nephrology，3Department of Research，Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China;4Department of Tumor＆Endocrinology，Mancheng County Hospital，Mancheng 072150，China;5Department of Pediatrics，Baoding First Hospital，Baoding 071000，China.E-mail: hdfyzhs1665@sina.com)

［ABSTRACT］AIM: To observe the effects of Egr-1 gene transfection on the expression of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)，and to investigate the role of Egr-1 in the pathogenesis of diabetic nephropathy.METHODS: The diabetic mouse model was established.Ten mice were randomly selected as the diabetic group.The remaining 40 mice were injected with empty plasmid，Egr-1 expression plasmid or Egr-1 siRNA plasmid via the tail vein once a week.The normal control group was also set up.The animals were sacrificed at the end of the 4th week.The renal tissues were harvested.The expressions of Egr-1，TNF-α and ICAM-1 were detected by immunohistochemistry and Western blot.The pathological changes were observed under electron microscope.RESULTS: In diabetic mouse kidney，the expression of Egr-1，TNF-α and ICAM-1 was increased，and irregular thickening of glomerular basement membrane，mesangial expansion and fusion of foot were observed.The change trend was more significant in Egr-1 gene transfection group，and these changes in siRNA plasmid transfection group were obviously reduced compared with diabetes group.CONCLUSION: Egr-1 up-regulates the expression of TNF-α and ICAM-1，and induces mesangial cell proliferation and mesangial extracellular matrix accumulation，which is probably one of the mechanisms of accelerating glomerulosclerosis.

［KEY WORDS］Early growth response protein 1; Gene transfection; Diabetic nephropathies; Tumor necrosis factor-α; Intercellular adhesion molecule-1

通訊作者△Tel: 0312-5981012; E-mail: hdfyzhs1665@sina.com

*［基金項目］保定市科學技術研究與發展指導計劃項目(No.13ZF115)

［收稿日期］2015-02-12［修回日期］2015-07-20

［文章編號］1000-4718(2015)09-1688-05

［中圖分類號］R392.11; R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.028