植物雌激素治療糖尿病肢體缺血性周圍神經病變的試驗研究

肖美群　劉偉信　張勇

[摘要]目的 研究植物雌激素對糖尿病大鼠周圍神經病變的影響，探討植物雌激素治療糖尿病周圍神經病變的可行性及療效。方法 ①建立大鼠動物模型。②藥物干預：植物雌激素治療組、陰性對照組、糖尿病組分別給予金雀異黃素、神經營養因子、生理鹽水肌注。③標本取材與制備：取大鼠脛神經切片光鏡和電鏡下觀察。④圖像分析：光鏡切片得到有髓纖維的髓鞘和軸突面積，神經內外膜的血管數。電鏡切片觀察有髓神經纖維和神經營養血管內皮的改變。結果 糖尿病組脛神經的有髓神經纖維和神經營養血管組織形態學出現明顯變化、陰性對照組正常，植物雌激素治療組有輕微變化。結論 植物雌激素治療糖尿病周圍神經病變是可行和有療效的。

[關鍵詞]植物雌激素；糖尿病；周圍神經病變

[中圖分類號]R587.2 [文獻標識碼]A [文章編號]1674-0742（2015）03（c）-0011-02

[Abstract] Objective To study the effect of phytoestrogen on diabetic peripheral neuropathy in rats， and investigate the feasibility and effect of phytoestrogen in the treatment of diabetic peripheral neuropathy. Methods①A rat animal model was established②Drug intervention： Phytoestrogen treatment group， negative control group， diabetes group was treated with intramuscular injection of genistein， neurotrophic factor， physiological saline， respectively.③Sample collection and preparation： Rat tibial nerve sections were collected and observed under light microscope and electron microscope.④Image analysis： Light microscopic sections obtained by myelinated fiber myelin and axon area， the number of inner and outer membrane of vascular nerve. The observation under electron microscope showed that there were changes in myelinated fibers and nerve nutritional vascular endothelium.⑤Statistical analysis： Morphological index of the image was analyzed statistically by variance analysis. Results The myelinated fibers and nerve nutritional vascular histomorphology of tibial nerve in the diabetic group appeared obvious changes， while those of the negative control group were normal， those of phytoestrogen treatment group had a slight change. Conclusion Phytoestrogen is feasible and effective in the treatment of diabetic peripheral neuropathy.

[Key words] Phytoestrogen；Diabetic；Peripheral neuropathy

該研究探討植物雌激素治療糖尿病周圍神經病變的可行性及療效，并從中進一步尋找植物雌激素更好地應用于臨床的方向。該科和廣東省人民醫院整形創傷血管外科合作于2012年5月—2014年3月做了如下研究。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物模型的建立

（SD）雌性大鼠（200～250 g）禁食一夜后單次腹腔內注射硫脲佐霉素60 mg/kg，1周后觀測鼠尾血糖≥16.7 mmol/L者入選，每2周復查血糖，<16.7 mmol/L的被排除。在模型建立后2周隨機選取20只模型大鼠雙后肢脛神經及10只正常雌性大鼠雙后肢脛神經行組織形態學觀察對比，建立模型。

1.2 藥物干預

按照隨機的原則對成功建立模型動物分為糖尿病組、陰性對照組和植物雌激素治療組，再分別分為2個月、4個月組亞組，每個亞組10只。植物雌激素治療組采用金雀異黃素（0.5 mg/kg體重）在造模后2周開始肌注，連續2或4個月。陰性對照組給予神經生長因子（800 u/kg體重）肌注。糖尿病組給予生理鹽水肌注。

1.3 標本取材與制備

糖尿病大鼠飼養2、4個月后，應用戊巴比妥（50 mg/kg）深度麻醉后，用4%多聚甲醛灌流固定，取大鼠雙后肢脛神經在相同的固定液中固定48 h，然后應用磷酸緩沖液沖洗，在鋨酸中固定，用乙醇脫水，Epon812包埋，半薄切片（厚1um）撈至玻璃片上，用甲苯胺藍染色，光鏡下觀察。然后超薄切片（厚度50～70 nm）、醋酸鈾染色，標本置于透射電鏡下觀察。

1.4 圖像分析

光鏡切片采用圖像分析儀對圖像進行分析，每個標本隨機采集5張圖像，每個圖像隨機選定10個有髓神經纖維進行測量，得到有髓纖維的髓鞘面積和軸突面積（um2），以及神經外膜和內膜的血管數。圖像分析結果顯示：與正常對照組相比，糖尿病模型神經纖維平均截面積略增大、有髓鞘神經纖維密度減少，軸索平均周長較正常組增大、神經外膜和內膜的血管數減少（P<0.01）。

電鏡切片觀察有髓神經纖維和神經營養血管內皮的改變。糖尿病模型組可見有髓鞘神經纖維板層分離，呈嚴重脫髓鞘現象，軸突內微絲微管排列紊亂。雪旺氏細胞核呈不規則形，胞質內粗面內質網擴張，線粒體呈空泡樣改變，雪旺氏細胞基膜斷裂。陰性對照組和植物雌激素治療組：髓鞘無崩解、變性；軸突線粒體無腫脹，微管、微絲無消失，神經營養血管內皮細胞無水腫，細胞間連接無斷裂，線粒體無腫脹。

1.5 統計方法

采用SPSS 13.00軟件包進行數據統計處理，計量資料以均數±標準差（x-±s）表示，計量數據對比應用t檢驗，計數數據應用c2檢驗。

2 結果

糖尿病模型組與陰性對照組和植物雌激素治療組相比，糖尿病模型神經纖維平均截面積略增大、有髓鞘神經纖維密度減少，軸索平均周長較正常組增大（P<0.01）。見表1。糖尿病模型組與陰性對照組和植物雌激素治療組相比， 神經外膜和內膜的血管數減少（P<0.01）。見表2。

3 討論

植物雌激素主要分為異黃酮、木酚素以及香豆素三大種類。其中異黃酮一般大量存在于黃豆或黃豆制品匯總，木酚素存在于蔬菜或谷物中，香豆素一般存在于發芽的豆類中。糖尿病血管病變包括微血管病變和大血管病變，是糖尿病慢性并發癥的病理基礎和核心環節。組織病理學研究顯示糖尿病微血管病變表現為毛細血管基底膜增厚，內皮細胞增生，管腔狹窄，神經外膜血管硬化及舒張功能障礙等。相關報道研究證實，植物雌激素能夠對胰島素分泌與作用產生影響，能夠有效改善胰島素敏感性、調整胰島素受體結合能力以及緩解氧化應激。

該次3組研究結果顯示，糖尿病組脛神經的有髓神經纖維和神經營養血管組織形態學出現明顯變化、陰性對照組正常，植物雌激素治療組有輕微變化。糖尿病模型組、植物雌激素治療組與陰性對照組的有髓神經纖維髓鞘面積和軸突面積平均值分別為394、370、363 um2；糖尿病模型組、植物雌激素治療組與陰性對照組的有髓神經纖維神經外膜和內膜的血管總數分別為6、21、35。糖尿病模型神經纖維平均截面積略增大、有髓鞘神經纖維密度減少，軸索平均周長較正常組增大（P<0.01）。表2糖尿病模型組與陰性對照組和植物雌激素治療組相比， 神經外膜和內膜的血管數減少（P<0.01）。該結果證明雌激素能促進內皮細胞生長，改善內皮細胞功能，延緩動脈粥樣硬化的發生發展；可誘導內皮生長因子的合成增加而促進內皮的愈合；還可提供持續的、低水平的抗氧化活性，對內皮細胞有保護作用。在動物糖尿病試驗中有證據顯示，神經組織會出現氧化應激增加及抗氧化劑保護酶活性受損。雌激素刺激前列環素的合成和釋放，從而抑制血小板聚集，改善膜的黏滯性，改善血液流變學。但對于植物雌激素在周圍神經尤其是缺血性周圍神經病變的作用有待進一步深化研究。眾多臨床試驗報道僅為短期觀察性試驗，樣本容量較小，對其潛在不良反應了解不夠深刻。當前植物雌激素對糖尿病肢體缺血性周圍神經病變的安全性與有效性還有待長期對照研究。

目前研究證實雌激素具有心血管系統的保護作用，對微循環的改善作用及對神經元及神經纖維的損傷的修復作用，降血糖作用。應用植物雌激素修復受損的神經可能是對糖尿病足的治療的新方法。

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（收稿日期：2014-12-20）