紅細胞免疫粘附功能及CR1 基因多態性對危重型手足口病的預警作用

趙瑞芹 付海燕 張麗霞 徐梅先 王鳳英 殷春蘭 安會波

自1969 年美國首次報道EV71 感染性疾病后［1］，世界多數國家發生了暴發流行，在大流行時期，EV71感染患者出現了嚴重的并發癥及死亡病例。我國臺灣地區在1998 至2008 年發生3 次暴發流行，因EV71 感染致死病例約為250 例［2］。大陸地區安徽阜陽2008年出現暴發流行，20 余例患兒死亡，隨后全國各地報道了該病的流行。近年每年均有手足口病暴發流行，并出現不少重癥病例及死亡病例。手足口病成為我國兒童期死亡的重要原因之一。多數手足口病臨床表現輕，預后較好。而重癥手足口病病情進展極為迅速，部分患兒就診時即有嚴重的腦損傷，并迅速進展為肺出血、肺水腫導致死亡。挽救重癥患兒、降低死亡率的關鍵在于早期識別重癥患兒。隨著對手足口病的關注增加以及研究的進一步深入，國內外學者分析總結了重癥手足口病患兒的高危因素，如年齡小于3 歲，持續發熱＞39℃，持續3 d 以上，血糖升高＞8.3 mmol/L，血常規白細胞＞17.5 ×109/L，肢體無力、心率增快等等［3－5］。文獻報道紅細胞免疫黏附功能、紅細胞CRl密度相關基因組多態性對腫瘤、糖尿病、腎病綜合征、嚴重膿毒癥，以及傳染性疾病如病毒性肝炎、嚴重急性呼吸綜合征等疾病具有臨床評估病情變化、療效觀察、判斷預后的重要指示意義［6，7］，其對手足口病的預警作用至今筆者尚未發現文獻報道。本研究通過探討紅細胞免疫黏附功能、CR1 基因多態性與手足口病的病情變化相聯系，通過對臨床病例的研究，建立有效的判斷預后指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2011 年4 月至2012 年2月期間我院住院手足口病患兒111 例?；純貉适米硬捎脤崟r熒光定量聚合酶鏈反應法檢測EV71，結果均為陽性?；加邢忍煨孕呐K病、免疫缺陷、腦癱等基礎疾病者，近期有麻疹、結核等傳染病史者及近期應用免疫球蛋白者不納入本研究。根據《腸道病毒71 型(EV71)感染重癥病例臨床救治專家共識》［8］，將患兒分為3 組。

1.1.1 死亡組:患兒入院后迅速進展至心肺衰竭，經積極救治無效死亡，共6 例。

1.1.2 危重組:患兒病程進展至手足口病心肺衰竭前期及心肺衰竭期，有心率、呼吸增快，出冷汗、皮膚花紋、四肢發涼，血壓升高，血糖升高，外周血白細胞(WBC)升高，病?；純撼霈F口唇紫紺、咳粉紅色泡沫痰或血性液體等表現，經積極救治，患兒逐漸恢復，共57 例。

觀察組34例中，有效23例，部分有效8例，無效2例，復發1例，總有效率為91.18%；對照組34例中，有效12例，部分有效15例，無效5例，復發2例，總有效率為79.41%，觀察組明顯優于對照組，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

1.3.4 瓊脂糖電泳:取12 ～15 μl 酶切反應液用2%瓊脂糖凝膠電泳。酶切后分3 種基因型。高表達(HH):只有與擴增物(1.8 kb)相同分子量一條帶的標本;中表達(HL):有1.8 kb、1.3 kb 和0.5 kb 三條帶;低表達(LL):只有1.3 和0.5 kb 兩條帶。

1.2 方法 患兒入院次日晨留取靜脈血3 ml，枸櫞酸鈉抗凝，分別進行以下檢測。

1.2.1 紅細胞天然免疫粘附功能檢測

1.2.1.1 血標本處理:將枸櫞酸鈉抗凝血2 ml 水平離心(2 000 r/min)，使紅細胞沉淀。

對照組接受常規護理，囑咐患者按時按量服藥，并基于患者的病情予以飲食指導，對患者日常生活進行精心照顧，預防產生各種意外事件的出現。

1)本自適應調節系統的靜態仿真實驗表明，系統控制的相對誤差均在5%以內，其中當該系統工作在半量程區間時，有著較好的控制精度。

散會后，大家一起到二樓的餐廳聚餐。席間，齊眉給每人分發了一個紅包。高潮拿到紅包后，心里直癢癢，瞅個機會跑到衛生間，偷偷地打開紅包，一看，壹仟圓，心里美滋滋的。高潮不想喝太多的酒，就賴在小隔間，坐在馬桶蓋上把玩手機耗時間，反正這里也很干凈，一絲兒異味都聞不到。不大會兒，就聽到外面兩個小便的人在交談。一個說，乖乖，好大方，紅包就裝了貳仟圓。另一個嚷嚷道，這狗日的梅董也太狗眼瞧人低了吧，只給了老子陸佰塊。高潮聽第一人說的時候，心中就詛咒了梅宏圖幾句，待第二個人的話一出口，高潮登時心平氣和了。

1.3.2 基因組擴增:取PCR 綠色體系(普洛麥格北京生物技術有限公司)12.5 μl 反應液。取上、下游引物(5’-CCTTCAATGGAATGGTGCAT-3’，5’-CCCTTGTAAGGCAAGTCTGG-3’)各1 μl 混勻液加入0.5 ml Eppendorf 管，加DNA 提取液3 μl 加雙蒸水使總反應體系至25 μl。擴增條件為:94℃預變性5 min;然后94℃，60 s;55℃，50 s;72℃，50 s 擴增30 個循環，最后72℃延伸5 min。

1.3.1 基因組抽提:應用血液基因組DNA 抽提試劑盒(北京賽百盛基因技術有限公司)抽提外周血DNA，實驗步驟按說明書進行。

1.2.1.4 結果判斷:輕輕將反應管中的液體搖勻，取反應液20 μl 置玻璃片中間，加蓋玻片，待細胞沉淀5 min 后，用相差顯微鏡閱片。結合5 個以上紅細胞的靶細胞為一個結單位，計數100 個靶細胞，計算粘附率。

1.3 紅細胞CR1 分子基因多態性檢測

1.2.1.3 加樣:取0.5 μl 紅細胞和50 μl 血漿加到靶細胞管，搖勻，37℃，水浴30 min。

1.2.1.2 靶細胞的配制:37℃溶解靶細胞，加1 ml PBS(磷酸鹽緩沖液)，充分混勻，水平離心4 000 r/min，離心5 min，棄凈上清液(勿將細胞吸掉)，加100 μl PBS 充分混勻，備用。

1.3.3 限制性內切酶酶切:基因擴增產物以Hind Ⅲ酶(普洛麥格北京生物技術有限公司)酶切，取6 μl 酶切反應液與14 μl PCR 擴增物混勻，置于37℃恒溫水浴箱內放置1 h，終止酶切。

1.1.3 對照組:患兒病程處于出疹期及神經系統受累期，有手掌、足底或臀部皮疹、口腔皰疹潰瘍，患兒出現精神差、嗜睡、易驚、頭痛、嘔吐、煩躁、肢體抖動、急性肢體無力等表現，本組所有患兒均未進展至心肺衰竭前期及心肺衰竭期，共48 例。

以建筑單體為基本評價單元,結合8個關鍵影響因子,用Excel表進行統計.屋頂綠化資源潛力評估方法見表2．

2.2 3組患兒紅細胞免疫粘附功能與CR1 基因多態性的比較 危重組患兒的紅細胞免疫粘附功能低于對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表2。

2 結果

2.2 仙居縣古樹分布區類型和變型 全縣現有古樹中含13個屬的科為殼斗科(Fagaceae)，有1 389株，占總數的28.46%；含有6個屬的科有薔薇科(Rosaceae)、榆科(Ulmaceae)和柏科(Cupressaceae)，共有250株，占總數的5.12%；含2～5個屬的科有20科，共有3 140株，占總數的64.34%。按照世界種子植物科的分布區類型[9]和中國種子植物屬的分布區類型[10] 標準劃分，可將仙居縣古樹科和屬的分布區類型分別劃分為10、20個類型(表2)。

表1 3 組一般情況比較

1.4 統計學分析 應用stata 10.0 統計軟件，采用Wilcoxon 秩和檢驗及Fisher 確切概率法，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

表2 3 組患兒紅細胞免疫粘附功能比較 ± s

表2 3 組患兒紅細胞免疫粘附功能比較 ± s

注:PS-C:危重組與對照組之間的差異;PS-D:危重組與死亡組之間的差異;PD-C:死亡組與對照組之間的差異

組別 紅細胞免疫粘附功能 統計值死亡組(n =6) 18.33 ±7.50 chi-squared with ties = 24.452 with 2 d.f ;P =0.0001危重組(n =57) 22.45 ±8.50 PS-C= 0.0000 (z = －4.307)對照組(n =48) 35.76 ±17.82 PS-D=0.0308 (z = －2.160)PD-C=0.0024 (z = －3.029)

2.3 3組之間CR1 基因多態性分布 危重組與對照組的CR1 基因多態性構成比的差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表3。

2.1 一般情況 危重組男37 例，女20 例;死亡組男4 例，女2 例;對照組男30 例，女18 例;危重組與死亡組患兒月齡之間差異無統計學意義(P ＞0.05)。2 組患兒月齡均小于對照組，2 組差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表1。

表3 3 組間CR1 基因多態性分布情況 例(%)

3 討論

手足口病目前在大陸地區仍有不同范圍不同程度的流行和小暴發，尤其是重癥、危重癥患兒，易造成神經系統后遺癥，對兒童的身心健康造成嚴重影響。我國2011 年發病人數為1 610 706 例次，死亡509 例，2012 年手足口病發病人數為2 168 737 例次，死亡567例，2013 年發病人數約1 467 694 例次，死亡約225例［2，3］。手足口病仍是嚴重威脅我國兒童生命健康的傳染病之一。

高熱、驚厥、惡心嘔吐、入院時中性粒細胞增高是重癥手足口病的危險因素，而年齡＜1 歲或＞5 歲，舒張壓偏高是保護性因素。臨床工作當中，上述部分因素有可能受到外界環境影響，如合并呼吸道或消化道感染、患兒恐懼、劇烈哭鬧等影響［9］。重癥手足口病患兒的預后因素目前已進行了多方面研究，但引起重癥手足口病的發病機制仍未完全清楚，推測可能與病毒直接侵犯組織細胞(如腦組織)或病毒入侵所致異常免疫反應有關。重癥致死病例可表現為迅速進展的交感神經緊張、肺水腫、肺出血、心肺衰竭，研究發現這些患兒心功能正常、肺動脈壓力正常、外周血管阻力正常，且尸檢并未發現心肌炎表現，因此心肺衰竭、肺水腫不能完全用血液動力學改變來解釋。而廣泛的系統炎性反應，釋放促炎因子參與腦干腦炎、肺水腫的形成，腦干損傷和(或)由于細胞因子釋放導致的系統炎性反應綜合征是形成肺水腫的重要原因，如白介素(IL-6、IL-10、IL-13)、腫瘤壞死因子(TNF-α)的升高以及CD4、CD8 和NK 細胞的損耗，與致命的肺水腫關系密切［10，11］。TNF-α 和IL-6 是調節免疫應答的細胞因子，是集體免疫防護的重要介質，但也參與集體的免疫病理損傷。TNF-α 介導炎癥反映的許多病理生理過程，促進炎癥細胞黏附、游走、浸潤級中性粒細胞脫顆粒，同時可以作用于單核巨噬細胞釋放炎性介質而加劇炎性反應，引起局部的免疫反映甚至系統損害。HFMD 患兒體內廣泛免疫炎性反應，高水平的前炎性因子進而激活其他效應細胞，引起連鎖反應及放大效應即瀑布效應引起SIRS 及多臟器功能障礙綜合征。

紅細胞是血循環中重要的天然免疫細胞之一，是機體對異物和免疫復合物起免疫粘附作用的主要細胞。由于血液循環中紅細胞與白細胞之比值為(500 ～1 000)∶1，因此紅細胞與外界侵入的異物或免疫復合物相遇的機會較白細胞要高很多，在機體免疫反應及其調控中占有重要的地位。成熟紅細胞膜表達CR1、CD44、CD58 等物質，對循環炎性物質具有重要的粘附結合及清除作用;其清除免疫復合物的方式主要有3 種，通過過氧化物酶直接消除粘附的抗原物質;促進吞噬細胞對抗原的吞噬;紅細胞本身不僅可以粘附免疫復合物，還可粘附自身T 細胞，將抗原提呈給T細胞，增強T 細胞的免疫功能，更有效地清除免疫復合物。本研究中，死亡組及危重組患兒紅細胞免疫粘附功能較對照組均有顯著下降，且2 組之間差異也具有統計學意義，提示紅細胞免疫粘附功能的不同程度的下降，導致對炎性介質清除能力的下降，分別與疾病的發展及預后密切相關。對入院手足口病患兒進行紅細胞免疫粘附功能的監測有助于了解HFMD 患兒預后，以及早進行干預，減少死亡率。

紅細胞發揮免疫功能尚需通過其表面的CR1 來進行。CR1 通過與機體內免疫復合物(IC)結合，將其運送至肝臟、脾臟的網狀內皮系統清除，以清除病灶。正常人紅細胞的CR1 呈高、中、低三種表達狀況，以HH 為主，HH 型紅細胞CR1 活性明顯高于HL 型和LL 型，是影響紅細胞免疫粘附功能的一個重要因素。CR1 的表達由CR1 基因HindⅢ酶切位點多態性遺傳決定，也與疾病有關。本研究中死亡組患兒CR1 以HL 型為主，占到50%，HH 型為33.33%，而危重組和對照組以HH 型為主，分別為77.19%、77.08%，與正常人相同。3 組之間的差異雖無統計學意義，但對CR1 呈中低表達的患兒尚需密切關注。

某防護結構墻體混凝土配合比優化及溫度控制………………………………………… 曾鳴，仲新波，揭英強（6-3）

紅細胞免疫是機體免疫的重要組成部分，近年來的研究使紅細胞免疫在免疫物質基礎、免疫功能等各個方面日趨完善。紅細胞免疫粘附功能對腫瘤、糖尿病、腎病綜合征、嚴重膿毒癥等疾病具有觀察療效、判斷預后的功能，本研究提示其對于重癥手足口病預后同樣具有預警作用。

手足口病病情進展快，病死率較高，對手足口病重癥患兒的早期識別仍是挽救患兒、降低死亡率的重要預防治療方法之一，發展更多的重癥手足口病預警指標具有重要意義。

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