放療聯合抑制STAT3 表達對腫瘤浸潤樹突狀細胞成熟的影響*

張啟芳，吳昌學，禹文峰，官志忠，柏 華

(1.貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫科大學第三附屬醫院 醫學實驗中心，貴州 都勻 558000)

套細胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma，MCL)是所有B 細胞非霍奇金淋巴瘤中預后較差的腫瘤之一［1－2］。MCL 患者對化療加單克隆抗體的一線治療初始反應良好，但幾乎所有的MCL 患者最終會復發，并對進一步的治療反應越來越差［3－5］。樹突狀細胞(dendritic cells，Dcs)是機體中最主要的抗原提呈細胞，在抗腫瘤免疫發應中起重要作用［6－9］。在腫瘤微環境中，腫瘤細胞分泌細胞因子白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)、白介素-11(interleukin-11，IL-11)、分泌轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等［10－14］抑制浸潤在腫瘤組織中的DCs 成熟，致使他們成為耐受性DCs，導致腫瘤細胞免疫逃逸。信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信號通路的激活是抑制DCs 成熟的一個關鍵［15－17］。本研究采用小鼠惡性B 細胞淋巴瘤A20細胞，利用低劑量放療誘導免疫原性的細胞死亡激活小鼠免疫系統，同時抑制STAT3 表達，探討聯合放療與抑制STAT3 表達對腫瘤浸潤樹突狀細胞(tumor-infiltrating dendritic cells，TIDCS)成熟的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

小鼠惡性B 細胞淋巴瘤A20 細胞購自美國ATCC 公司，STAT3 探針購自Universal Probe Library(UPL)，兔抗STAT3(sc-8019)、羊抗β-actin(sc-1616)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(ZB-2301)、兔抗羊二抗(ZB-2306)購自美國Santa Cruz 公司，小鼠DCs 富集試劑盒(The StemSepTMMouse Dendritic Cell Enrichment Kit)購自加拿大STEMCELL Techonolgies 公司，熒光標記抗體主要組織相容性復合體(MHC)II、CD40、CD80 購自美國eBiosciences，Phospho-Tyr705-STAT3 Alexa Fluro647 購自BD Biosciences，胎牛血清、1x Antibiotic-Antimycotic、1640 培養液Gibco 公司，RNeasy Plus kit 購自Qiagen 公司，cDNA 合成試劑盒(iScript)購自Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 把A20 細胞放于含10%胎牛血清和1x Antibiotic-Antimycotic 的RPMI 1640 培養液，5%CO2的37 ℃培養箱中培養。

1.2.2 小鼠帶瘤實驗 在100 μL 1×PBS 中制備含5×106的A20 細胞懸浮，并接種于BALB 小鼠大腿皮下。根據公式V=L×W2/2 計算腫瘤體積(V 為體積，L 為瘤體的長，W 為寬)。待瘤塊長至約150 mm3時，隨機分為3 組，每組6 只，分別為PBS組、放療+空質粒組(RT+empty)、放療+shRNA(RT+shRNA)組，分別于放療前、放療當天和第二天瘤內注射等量1×PBS、空載體和STAT3 基因特異pFLU-EGFP-Puromycin STAT3 shRNA 質粒(按小鼠體重0.50 mg/kg)，放療前瘤內注射STAT3 基因特異shRNA 質粒1 次，腫瘤處放療10 Gy，放療當天和第二天按小鼠體質量0.50 mg/(kg·次)瘤內注射質粒。放療第三天收腫瘤。

1.2.3 腫瘤CDs 富集 用手術刀切碎腫瘤組織，加入膠原蛋白酶-IV/脫氧核糖核酸酶I(DNaseⅠ)處理，置于含5%CO2的37 ℃培養箱30 min，加入細胞培養液RPMI，2 000 r/min 離心10 min，用RPMI 洗細胞一次，計數細胞;按小鼠DCs 富集試劑盒說明書操作，富集小鼠TIDCs，用流式細胞儀驗證。

1.2.4 STAT3 mRNA 表達水平 采用熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)方法，采用RNeasy 試劑提取細胞總RNA，按iScript 反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，用qPCR 檢測STAT3 mRNA 表達水平。用ProbeFinder Version 2.45(Roche)軟件設計探針－引物，探針購自Universal Probe Library(UPL)，STAT3 上游引物序列為5'-CTGCCTAGATCGGCTAGAAAAC-3'，下游引物序列為5'-CCCTTTGTAGGAAACTTTTTGC-3'，內 參 照TATA-box binding protein(TBP)采 用Roche’s Reference Assays。qPCR 反應條件為95 ℃30 s，95 ℃5 s、60 ℃30 s(40 個循環)。采集待測基因和內參照TBP 的熒光信號值，計算ΔΔCt 及相對含量(RQ)，RQ=2–ΔΔCt。

1.2.5 細胞內或細胞膜蛋白染色 染色緩沖液洗腫瘤DCs 1 次，小鼠CD16/32 抗體和小鼠血清封閉細胞膜FcγII/III 受體，冰上孵育10 min，2 000 r/min 離心10 min(細胞內蛋白需用1.6%多聚甲醛固定、預冷的甲醇破膜，染色緩沖液清洗2 次，每次2 000 r/min 離心10 min)，加入用染色緩沖液稀釋熒光標記抗體，冰上避光孵育30 min，染色緩沖液清洗2 次，重懸細胞，用流式細胞儀收集數據，用flowjo 軟件(treestar)分析數據。

1.3 統計學分析

采用Graphpadprism 6.0 自帶統計分析軟件處理數據，每組實驗重復3 次，數據均以均數±標準差)表示。多組單變量實驗間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA);P ＜0.05 為差異有統計意義。

2 結果

2.1 STAT3 mRNA 和STAT3 磷酸化蛋白表達水平

與PBS 組和RT+empty 組比較，RT+shRNA組STAT3 mRNA 表達水平和磷酸化STAT3 蛋白表達水平均顯著降低，差異有統計學意義(P ＜0.05)，分別被抑制了50%～60%和80%，說明放療聯合STAT3 基因特異的shRNA 可以有效地抑制腫瘤侵潤DCs 中STAT3 表達。

2.2 TIDCs 表面分子MCHII、CD40 及CD80 的表達水平

與PBS 組和RT+empty 組比較，RT+shRNA組MHCH、CD40及CD80平均熒光強度均顯著增加，差異有統計學意義(P ＜0.05)，分別增加了50%、60%和80%，說明放療聯合STAT3 基因特異的shRNA 可以有效增加TIDCs 表面分子MCHII、CD40 及CD80 的表達水平。

圖1 TIDCs STAT3 mRNA 和STAT3磷酸化蛋白表達水平Fig.1 Radiotherapy combined with STAT3 shRNA silencesd STAT3 mRNA and decreased STAT3 Activity

圖2 TIDCs 表面分子MHCII、CD40 及CD80 的表達水平Fig.2 The expression levels of MHCII，CD40 and CD80

3 討論

MCL 是一種進展快、無法治愈的B 細胞非霍奇金淋巴瘤亞型。本研究應用STAT3 基因特異pFLU-EGFP STAT3 shRNA 質粒注射惡性B 細胞淋巴瘤并給予腫瘤處10 Gy 放療處理，探討腫瘤侵潤DCs 表面分子MHCII、CD40 及CD80 的表達水平，結果發現，應用STAT3 基因特異shRNA 聯合放療可上調腫瘤侵潤DCs 的表面MHCII 類分子與共刺激分子(CD40 和CD80)的表達，有效地促進腫瘤侵潤DCs 成熟。

免疫細胞能夠殺死腫瘤化療耐藥細胞［7－8］，激活MCL 患者的免疫系統可引起機體持續的免疫應答［12］。因此，激活具有抗原提呈功能的DCs 成為治療腫瘤的首先策略之一。DCs 遷移能力強，浸潤到腫瘤組織，但腫瘤細胞分泌細胞因子可抑制浸潤在腫瘤組織中的DCs 成熟，成為耐受性DCs［10－14］。耐受性DCs 表面MHC Ⅱ類分子與共刺激分子(CD40 和CD80)均為低表達或不表達，不能有效的提呈抗原激活CD8+T 細胞殺傷腫瘤細胞，導致了腫瘤細胞免疫逃逸［6－9］。STAT3 調控DCs 分化和成熟，抑制STAT3 表達能促進DCs 分化和成熟［10－12，15－16］。放療在殺死腫瘤細胞的同時，還誘導細胞死亡，因死亡細胞具有免疫原性，激活機體免疫系統，消除遠端病灶［18－19］;但大劑量放療對癌癥患者副作用較大，臨床常使用小劑量多次放射療法。但對于放療后復發患者，放療效果較差;前人和筆者前期研究發現，放療誘導的死亡細胞也釋放如線粒體DNA、IL-6 等因子激活殘余腫瘤細胞中的STAT3 蛋白，激活的STAT3 蛋白又促進腫瘤生長，引起復發［20］。這就造成多次放療誘導腫瘤細胞多次死亡，但又多次激活腫瘤細胞中的STAT3蛋白，持續性促進腫瘤生長。因此本研究嘗試一次放療聯合抑制STAT3 表達是否能殺死腫瘤細胞，協同激活免疫系統，抑制殘余腫瘤細胞的STAT3表達，規避放療的不足，阻止腫瘤復發。結果發現一次放療聯合抑制STAT3 表達在降低STAT3 mRNA 表達水平的同時引起STAT3 磷酸化蛋白表達下降，上調TIDCs 的表面MHCⅡ類分子與共刺激分子(CD40 和CD80)的表達，促進TIDCs 成熟。這種聯合治療是否能增強惡性B 細胞的免疫原性功能還有待進一步研究。

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