抑制STAT3表達增強多西他賽對人前列腺癌細胞的抗腫瘤作用

抑制STAT3表達增強多西他賽對人前列腺癌細胞的抗腫瘤作用*

**通信作者 E-mail:842031616@qq.com

網絡出版時間：2015-10-13網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20151013.1248.022.html

張啟芳， 吳昌學， 官志忠

(貴州醫科大學 分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 研究抑制信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)的表達增強多西他賽對人前列腺癌細胞DU145的抗腫瘤作用的影響。方法： 用慢病毒pFLU-EGFP shSTAT3質粒轉染人前列腺癌細胞DU145、構建抑制STAT3的穩定細胞株作為shRNA組，轉染空載體作為空白對照(mock)組，采用Western blot方法檢測兩組人前列腺癌細胞DU145上STAT3 和Bcl-2蛋白表達，用Annexin V /PI 染色法測定經過多西他賽處理的已抑制STAT3表達的DU145細胞的細胞凋亡；成瘤實驗檢測采用STAT3抑制與多西他賽(DOX)聯合分別注射接種于雄性免疫缺陷小鼠(NSG)的DU145腫瘤和腹腔，觀察接種22 d時的小鼠體質量和腫瘤體積。結果： pFLU-EGFP STAT3 shRNA載體在沉默STAT3基因表達后，人前列腺癌細胞DU145中抗凋亡基因Bcl-2表達下調，顯著降低STAT3和Bcl-2蛋白表達水平；抑制STAT3表達后DU145細胞對多西他賽敏感性顯著增加，凋亡細胞顯著增多，對多西他賽的敏感性提高了4倍；小鼠成瘤實驗表明，接種Dox+shRNA小鼠體質量和腫瘤體積明顯下降，抑瘤率增加約80%。結論： 抑制前列腺癌DU145細胞中STAT3表達能增強多西他賽抗癌的敏感性，STAT3抑制與多西他賽聯合注射接種可增強多西他賽對人前列腺癌的抗癌效果。

[關鍵詞]抑制信號轉導與轉錄激活因子3； 前列腺癌細胞； 多西他賽； 細胞凋亡； 敏感性

[基金項目]*國家自然科學

[中圖分類號]R737.25； R34-33[文獻標識碼] A

Effect of BlockingSTAT3 Augments on Resistance of

Human Prostate Cancer Cells to Docetaxel

ZHANG Qifang, WU Changxue, GUAN Zhizhong

(KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To investigate the effect of STAT3 silencing on the sensitivity of human prostate cancer cells to docetaxel treatment. Methods: Lentiviruses expressing STAT3-specific shRNA were used to infect human prostate cancer DU145 cells to generate a stable cell line as shRNA group, non-specific shRNA as mock group. STAT3 expression and Bcl-2 expression were detected by Western blot. Apoptosis induced by docetaxel was assessed by Annexin V/PI Staining. To determine the effect of STAT3 inhibition on anti-tumor effect of docetaxol in vivo, STAT3 shRNA plasmid and doectaxol were injected into subcutaneous DU145 tumors and perifeneals of NSG immunodeficient male mice,respecti-vely. Tumor weights and tumor volumes were examined at 22 d after implantation. Results: STAT3 expression was significantly silenced. STAT3 silencing resulted in the downregulation of its downstream target, an anti-apoptotic gene Bcl-2. The apoptotic cell death induced by docetaxel was significantly augmented by STAT3 inhibition and apoptotic cells had 4-fold increase compared mock group. Tumor formation assay showed that the tumor weight and tumor volumes in DOX+shRNA group were remarkably decreased when compared to mock+DOX group. The tumor inhibition was about 80% in DOX+shRNA group. Conclusions: STAT3 silencing enhances the sensitivity of Du145 cells to docetaxel and antitumor effect of docetaxel.

[Key words] signal transducer and activator of transcription 3; prostate cancer cells; docetaxel; apoptosis; sensitivity

雄激素剝奪療法最初能有效治療對雄激素有反應的前列腺癌患者，但大多2~3年后癌癥復發，并發展成為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)。目前尚無CRPC的有效治療方法，多西他賽是第一線CRPC的抗癌藥，僅約48%患者對多西他賽治療有效果，但會迅速出現耐藥性[1-3]。信號轉導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)蛋白在許多小鼠和人腫瘤細胞呈持續性激活狀態，持續性激活的STAT3蛋白能刺激癌細胞增殖、抗凋亡、侵襲遷移及免疫抑制等[4-7]。激活或高表達的STAT3蛋白促進前列腺癌細胞抗凋亡、轉移和耐藥性[3, 8-12]，本課題前期研究發現，用STAT3基因特異的shRNA抑制STAT3表達后，可阻礙CRPC細胞生長和侵襲遷移力，STAT3靶基因Bcl-2是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，可以抑制由多種細胞毒因素所引起的細胞死亡。本研究以人前列腺癌細胞DU145和雄性免疫缺陷小鼠(NOD-SCID IL-2receptor gamma null mice，NSG)為模型，觀察抑制STAT3的表達對人前列腺癌細胞DU145的多西他賽的耐藥性的影響。

1材料與方法

1.1　藥物與試劑

多西他賽(Docetaxel)購自Sigma公司，人前列腺癌DU145細胞購自美國ATCC ，10%胎牛血清購自Sigma公司，DMEM培養液購自Gibco公司，Antibiotic-Antimycotic購自Gibco公司，RNeasy Plus kit 購自Qiagen公司，cDNA合成試劑盒(iScript)購自Bio-Rad公司，兔抗STAT3 (sc-8019)、羊抗β-actin (sc-1616)、Bcl-2(Santa Cruz)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(ZB-2301)、兔抗羊二抗 (ZB-2306) 購自美國Santa Cruz公司， ECL超敏免疫印跡檢測試劑購自Amersham公司)，Annexin V/PI 雙染色法凋亡試劑盒(88-8007) 購自美國eBiosciences，Lipoectamine 2000 購自美國Invitrogen, 聚凝胺購自Sigma公司。

1.2　方法

1.2.1細胞培養及處理人前列腺癌DU145細胞在含10%胎牛血清、1× Antibiotic-Antimycotic的DMEM培養液，5% CO2的37 ℃培養箱中培養。

1.2.2穩定轉染pFLU-EGFP STAT3 shRNA細胞株的構建 采用pFLU-EGFP-Puromycin STAT3 shRNA 質粒，轉染前18～20 h，將293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養液傳代，待細胞長至70%～80%時換無抗生素DMEM培養液，按空白載體或質粒進行三包裝系統與脂質體轉染，室溫靜置20 min，加入293T細胞，培養48 h收集上清，2 000 r/min離心15 min，收上清， 即為表達STAT3 shRNA慢病毒懸浮液。加培養基按1∶1比例稀釋STAT3 shRNA慢病毒懸浮液，加入聚凝胺至終濃度為8 μg/mL后。室溫靜置15 min，緩慢加入目的細胞DU145，5% CO2、37 ℃培養箱18 h，更換培養液，繼續培養60 h，收集細胞，用流式細胞儀分選出熒光GFP陽性細胞作為shRNA組。采用轉染空載體作為空白對照組(mock)，方法同上。

1.2.3STAT3和Bcl-2蛋白表達水平蛋白印跡(Western Blot)法檢測，收集細胞，提取總蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF膜上，常規一抗和二抗孵育后， ECL超敏免疫印跡檢測試劑檢測蛋白表達，用Image J軟件分析圖像強度。

1.2.4細胞凋亡實驗用多西他賽處理shRNA組和Mock組細胞，終濃度為1.0 nmol/L，在37 ℃、5% CO2培養箱孵育48 h，收集細胞用Annexin V/PI 雙染色法凋亡試劑盒(88-8007)檢測細胞凋亡，以Mock組作為空白對照，按使用說明書操作。樣品準備好后上流式細胞儀測試，數據用FlowJo V6 軟件分析。

1.2.5體內抗腫瘤實驗 在100 μL 1×PBS中制備含中5×106的 DU145細胞懸浮，并接種于雄性NSG小鼠腹部皮下。根據公式V=L×W2/2計算腫瘤體積(V為體積，L為瘤體的長，W為寬)；待瘤塊長至約150 mm3時，將NSG鼠隨機分為3組，每組6只，分別為Mock組、多西他賽(Dox)+Mock組及Dox+shRNA組，Mock組瘤內注射空載體，Dox+Mock組瘤內注射空載體，2 d注射1次，0.50 mg/(kg·次)，Dox+shRNA瘤內注射pFLU-EGFP STAT3 shRNA載體，后兩組于接種后第10天、14 天和18天腹腔注射DOX，劑量為1 mg/(kg·次)；第22天，稱取NSG小鼠體質量，處死小鼠，分別測量瘤體的L、W計算腫瘤V。

1.3　統計學分析

采用Graphpadprism 6.0自帶統計分析軟件處理數據，每組實驗重復3次，數據均以均數±標準差()表示；兩組差異采用t檢驗，多組單變量實驗間的差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，不同組腫瘤體積差異采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)， 以P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1　STAT3和Bcl-2蛋白表達

結果顯示 shRNA組STAT3蛋白表達水平約為Mock組的40%，被抑制約60%； Bcl-2蛋白水平約為Mock組的40%，被下調了60%，見圖1；說明pFLU-EGFP-Puromycin STAT3 shRNA載體可以通過抑制DU145細胞中STAT3的表達，下調STAT3的抗凋亡靶基因Bcl-2的蛋白水平。

(1)與mock組比較， P<0.05 圖1　STAT3和Bcl-2蛋白表達水平 Fig.1　Protein expression levels of STAT3 and Bcl-2

2.2　轉染后DU145細胞對多西他賽的敏感性

與Mock組和Mock+Dox組相比,Dox+shRNA的DU145細胞凋亡率顯著增高，差異有統計學意義(P<0.05)；抑制STAT3表達的DU145細胞對多西他賽的敏感性提高了4倍。見圖2。

(1)與mock比較，P<0.05; (2)與mock+Dox比較，P<0.05 圖2　轉染后DU145細胞對多西他賽的敏感性 Fig.2　STAT3 silencing enhances the sensitivity of DU145 cells to Docetaxol

2.3　抑制STAT3增強了多西他賽抗腫瘤效果

接種第22天，與Mock組和Mock+Dox組相比,Dox+shRNA腫瘤質量明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；Mock組平均的瘤體積為1 689.5 mm3，Mock+Dox平均瘤體積為902.1 mm3，而shRNA + Dox的平均瘤體積為109.6 mm3，對腫瘤生長的抑制率達到了近80%，見圖3。說明抑制STAT3增強了多西他賽抗腫瘤效果。

(1)與mock組比較， P<0.05; (2)與mock+Dox比較， P<0.05 圖3　抑制STAT3表達增強了多西他賽抗腫瘤效果 Fig.3　STAT3 inhibition augments antitumor efficacy of Docetaxol

3討論

多西他賽是治療去勢抵抗前列腺癌(CRPC)病人的第一線治療藥物，但這些病人迅速出現多西他賽耐藥，臨床急需尋求有效的解決方法。

STAT3活化可激活轉錄下游抗凋亡基因的表達，抑制細胞凋亡；抑制STAT3活性可以促進前列腺癌細胞凋亡[13]。腫瘤干細胞標記乙醛脫氫酶(ALDH)陽性的DU145細胞表達高水平的磷酸化STAT3蛋白。有研究發現用STAT3抑制劑處理DU145細胞后，可減少ALDH陽性細胞數，誘導DU145 ALDH陽性細胞的凋亡[14]。用小白菊內酯抑制STAT3轉錄活性，可誘導從多種前列腺癌細胞株分離出的腫瘤起始細胞凋亡，并阻止他們在體內生長[15]。DU145細胞比多數前列腺癌細胞如LnCap細胞對多西他賽耐藥，本研究發現， Dox+shRNA的DU145細胞凋亡率顯著高于Mock組和Mock+Dox組(P<0.05)，抑制STAT3表達的DU145細胞對多西他賽的敏感性提高了4倍，說明STAT3活性可能是DU145細胞對多西他賽耐藥的主要原因之一。本研究抑制STAT3基因表達后，下調抗凋亡靶基因基因Bcl-2的表達，增強了DU145細胞對多西他賽的敏感性，凋亡細胞顯著增多，提示聯合抑制STAT3蛋白表達和多西他賽可能可增強多西他賽的抗腫瘤效果。本研究體內抗腫瘤實驗結果顯示在接種后第22 天，腫瘤質量明顯下降，多西他賽對腫瘤生長的抑制率達到了近80%。提示抑制STAT3表達能顯著增強多西他賽對人前列腺癌的抗癌效果，說明聯合治療具有較好的協同作用。

綜上所述，多西他賽聯合pFLU-EGFP STAT3 shRNA載體接種表現出很好的協同抗瘤效果，加之RNA干擾技術副作用小，表明RNA干擾技術在抗腫瘤治療方面很有前景。但針對轉移性癌癥，如何靶向輸送RNA干擾片段到目的組織和細胞還需進一步的研究。

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(2015-09-02收稿，2015-09-29修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 周凌